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長沙瀚辰生物
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地高辛標(biāo)記探針技術(shù)
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1 簡介 1988年，德國人Dooley等首次用地高辛標(biāo)記的探針檢測了結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，這種方法操作方便、干擾少，可以在兩天內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果。DIG系統(tǒng)是在多種應(yīng)用中標(biāo)記和檢測核酸的首選非放射性技術(shù)。該系統(tǒng)基于從洋地黃植物（紫毛地黃和狹葉毛地黃）中分離的類固醇，這些植物是地高辛的唯一天然來源，因此抗DIG抗體不與其他生物材料結(jié)合，可確保特異性標(biāo)記。 地高辛配基標(biāo)記的核酸探針技術(shù)，具有較高的靈敏度，也克服了放射性同位素標(biāo)記技術(shù)所固有的缺陷以及生物素系統(tǒng)的不足之處，加上本身方法的不斷改進(jìn)，日益顯示出優(yōu)越性和廣泛的應(yīng)用前景。地高辛配基標(biāo)記核酸探針自應(yīng)用以來，迅速地從檢測蛋白質(zhì)推廣到檢測細(xì)菌、病毒等微生物，甚至開始檢測腫瘤和各種激素，逐漸取代了放射性標(biāo)記探針和生物素標(biāo)記探針。目前地高辛配基檢測體系已廣泛用于核酸研究分析的各個方面，如Southern印跡檢測特定基因組序列、進(jìn)行RFLP分析用于基因診斷、基因表達(dá)、菌落或噬菌斑原位雜交、固定細(xì)胞及中期染色體原位雜交以及生物體液中病毒DNA序列的檢測。 以下簡要介紹幾種常用的地高辛標(biāo)記物及標(biāo)記方法和檢測原理。 2 地高辛標(biāo)記物 地高辛配基標(biāo)記核酸探針方法很多，不同標(biāo)記方法使用的地高辛標(biāo)記物各不相同，常用的地高辛標(biāo)記物有DIG-NHS、DIG-MAL、DIG-11-dUTP等。 ① Digoxigenin NHS ester：(DIG-NHS)：核酸探針5'末端的氨基殘基；蛋白分子N端氨基或側(cè)鏈帶氨基的氨基酸殘基；其他含氨基殘基的生物分子。 ② Digoxigenin maleimide(DIG-MAL)：硫醇取代的寡核苷酸探針的巰基（-SH）；蛋白分子側(cè)鏈含巰基（-SH）的氨基酸殘基；其他含巰基（-SH）的生物分子。 ③ Dig-11-dUTP：隨機(jī)引入核酸探針中間；或在3’末端加上多個地高辛殘基的尾巴。 ④ Dig-11-ddUTP：在核酸探針3'末端只添加一個地高辛殘基。 3.地高辛配基標(biāo)記方法 3.1 寡核苷酸探針標(biāo)記方法 3.1.1 3'末端標(biāo)記法 3'末端標(biāo)記法的主要特點是在每個合成的寡核苷酸(長度為14~100bp)的3'末端只添加一個地高辛殘基(DIG-ddUTP)。用此方法標(biāo)記寡核苷酸時，除末端轉(zhuǎn)移酶外，無需其它特別的寡核苷酸合成試劑，方便快捷。所合成的探針適合于要求探針具有較高的特異性而靈敏度一般的試驗，如Southern印跡、Northern印跡、斑點印跡及菌落P噬菌斑雜交實驗。 3.1.2 3'末端加尾法 3' 末端加尾法是由末端轉(zhuǎn)移酶在探針3'末端加上數(shù)個地高辛殘基的尾巴。此方法標(biāo)記的探針靈敏度較3'末端標(biāo)記法要高出10倍左右，但由于存在長尾巴，往往會出現(xiàn)較嚴(yán)重的非特異性背景。 3.1.3 5'末端標(biāo)記法 5'末端標(biāo)記法是通過化學(xué)方法將地高辛標(biāo)記于寡核苷酸的5'末端。首先在5'末端連接上一個氨基連接臂殘基，將合成的寡核苷酸純化后，再使DIG-NHS與5'末端的氨基殘基發(fā)生共價結(jié)合，從而形成標(biāo)記探針。這類探針的一個主要優(yōu)點是其3'端在DNA合成反應(yīng)中充當(dāng)引物，使反應(yīng)產(chǎn)物得以標(biāo)記。 3.2 DNA探針的標(biāo)記方法 3.2.1 隨機(jī)引物法 隨機(jī)引物法是由美國Johns-Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Feinberg等創(chuàng)立。用DNase I隨機(jī)切割DNA，分離，收集長約6-8個核苷片段作為隨機(jī)引物。以DNA為模板，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作為合成底物，加入隨機(jī)引物，當(dāng)這些引物各自按堿基互補(bǔ)原則與模板上的不同區(qū)段結(jié)合后，在Klenow酶的作用下即從引物的3’-OH-end開始合成互補(bǔ)DNA鏈，即可獲得標(biāo)記的DNA探針。這種方法一般可允許10ng-3μg范圍內(nèi)探針有效地標(biāo)記。標(biāo)記前的DNA要經(jīng)加熱變性成為單鏈，標(biāo)記效率較高，一般每20-25個核苷酸摻入一個Dig-11-dUTP，標(biāo)記探針長度可為在200-2000bp不等。 3.2.2 PCR 摻入法 這種標(biāo)記方法是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在Taq酶的作用下，將DIG-11-dUTP摻入到新合成的DNA鏈中。以本法標(biāo)記的探針不但靈敏度高，產(chǎn)量也很高。少量的基因組DNA(1ng～50ng)便可直接通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記。 4 地高辛標(biāo)記探針的顯色檢測 地高辛配基（DIG）是一種具有高抗原性的小分子半抗原，地高辛配基標(biāo)記的生物分子與高親和力和特異性的抗地高辛配基抗體結(jié)合可用于生物檢測。對于DIG標(biāo)記探針的雜交檢測，可選用連接有堿性磷酸酶（alkaline phosphatase），過氧化物酶(peroxidase)，熒光素（fluorescein），羅丹明（rhodamine）或是膠體金（colloidal gold）高親和性的抗DIG抗體共軛物；也可選用不帶任何共軛連接的抗DIG抗體和二級抗體。以下簡要介紹化學(xué)發(fā)光、熒光及化學(xué)顯色等檢測方法及原理。 4.1 化學(xué)發(fā)光檢測 抗地高辛-AP(AP，堿性磷酸酶)識別并特異性結(jié)合地高辛半抗原，形成酶聯(lián)抗體-半抗原復(fù)合物，再加入化學(xué)發(fā)光底物AMPPD、CDP Star、APS-5等，通過儀器以記錄化學(xué)發(fā)光信號。 4.2 熒光檢測 與化學(xué)發(fā)光檢測類似，熒光檢測法是利用FITC、Rhodamin、Cy3、Cy5以及各種新型熒光染料標(biāo)記的地高辛單克隆抗體和雜交后探針上的地高辛結(jié)合，形成抗體-半抗原復(fù)合物，直接進(jìn)行熒光信號檢測。 4.3 化學(xué)顯色 化學(xué)顯色同化學(xué)發(fā)光檢測的顯色原理相同，都是通過類似ELISA實驗的程序加以檢測，不同的是化學(xué)顯色加入的是顯色底物，在酶促作用下發(fā)生反應(yīng)，于數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生肉眼可見的不溶性有色物質(zhì)，然后進(jìn)行比色。例如，用抗地高辛的抗體和雜交后探針上的地高辛結(jié)合，抗體帶有堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶（HRP），然后加入堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的顯色底物顯色，堿性磷酸酶可用5-溴-4-氯-3吲哚酚磷酸鹽(也稱X-磷酸鹽，BCIP)和氮藍(lán)四唑鹽(NBT)等顯色，辣根過氧化物酶可用AEC等顯色。在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan。而AEC顯色底物則在過氧化物酶的催化下，被氧化氫氧化形成穩(wěn)定的紅色沉淀產(chǎn)物。 5 技術(shù)難點 在生產(chǎn)地高辛衍生產(chǎn)品時，合成及純化過程較困難： 1）地高辛衍生產(chǎn)品合成過程易開環(huán)，并且收率比較低； 2）地高辛衍生產(chǎn)品均為化學(xué)性質(zhì)活潑的結(jié)構(gòu)，在生產(chǎn)及儲存過程極易降解變質(zhì)； 3）地高辛衍生產(chǎn)品純化工藝難度大，純化過程也易使產(chǎn)品變質(zhì)，致使產(chǎn)品收率低。 由于地高辛類產(chǎn)品存在的上述問題，導(dǎo)致國內(nèi)同類產(chǎn)品存在質(zhì)量低下、批次不穩(wěn)定的問題，而進(jìn)口產(chǎn)品價格高昂。 |
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