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qPCR的內(nèi)參，你選對了嗎？
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熒光定量 PCR 的主要用途之一是對RNA進(jìn)行相對定量分析，而提到相對定量，必然離不開內(nèi)參，那什么是內(nèi)參基因？為什么相對定量必須使用內(nèi)參基因？如何選擇合適的內(nèi)參基因？今天，小助手聊聊實(shí)驗(yàn)室遇到的內(nèi)參那些事。 一、什么是內(nèi)參基因？ 內(nèi)參基因，也稱為管家基因，即是內(nèi)部參照，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。所以叫內(nèi)參基因。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下不會(huì)發(fā)生表達(dá)改變的基因作內(nèi)參。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18 sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP內(nèi)參基因等。 二、為什么相對定量必須使用內(nèi)參？ 那內(nèi)參基因與相對定量又有什么樣的關(guān)系呢？我們通過以下實(shí)驗(yàn)案例一起了解一下。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簻y定肝癌細(xì)胞A基因相對于正常肝細(xì)胞的表達(dá)量。通過熒光定量檢測可得：肝癌細(xì)胞中A基因的CT=25，正常肝細(xì)胞中A基因的CT=26，所以，利用表達(dá)量倍數(shù)計(jì)算公式2-△CT計(jì)算，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的A基因表達(dá)量是正常肝細(xì)胞表達(dá)量的2倍。 但是，以上結(jié)論成立的前提是：必須保證兩盤細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量完全一致；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及qPCR擴(kuò)增效率完全一致；不存在操作誤差等。這顯然是無法達(dá)到的。 因此，為了將樣本處理歸一化，引入一個(gè)內(nèi)參進(jìn)行校正�；谇懊鎸�(nèi)參基因特點(diǎn)的描述，我們知道內(nèi)參基因在兩類細(xì)胞（正常肝細(xì)胞/肝癌細(xì)胞）中的表達(dá)量是相對一致的，所以可以對細(xì)胞上樣量、細(xì)胞上樣過程中存在的誤差、實(shí)驗(yàn)過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差等進(jìn)行校正。再來看一下引入內(nèi)參后A基因的表達(dá)量。 肝癌細(xì)胞A基因 CT= 25，內(nèi)參基因CT= 20；正常肝細(xì)胞A基因CT= 26，內(nèi)參基因CT= 22。所以，內(nèi)參校正后，肝癌細(xì)胞中的A基因表達(dá)量是正常肝細(xì)胞表達(dá)量的1 / 2倍（計(jì)算公式 2-△△CT）。 由此可見，若想有效檢測一個(gè)特定基因的相對表達(dá)情況，選擇內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理非常重要！ 三、如何選擇合適的內(nèi)參？ 首先，是內(nèi)參的獲得。常見內(nèi)參獲取的途徑有如下三個(gè)： 途徑一：通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)，獲取內(nèi)參。 途徑二：通過查詢數(shù)據(jù)庫，獲取內(nèi)參。 網(wǎng)址：https://icg.big.ac.cn/index.php/ Homo_sapiens 四、總結(jié) 綜上所述，在相對定量檢測中，最重要的是選擇合適的內(nèi)參基因；而選擇合適的內(nèi)參基因中，最重要的，則是實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因在不同處理間的表達(dá)穩(wěn)定性。選擇合適的內(nèi)參，是相對定量成功的開端！ |
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