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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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免疫組化實(shí)驗(yàn)遇到的問(wèn)題分析及改進(jìn)方法
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免疫組化實(shí)驗(yàn)遇到的問(wèn)題分析及改進(jìn)方法 1、石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象 1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度； 2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購(gòu)買到或這自己做； 3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。 2、邊緣效應(yīng) 1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。 2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。 解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。 3、產(chǎn)生組織切片非特異性染色 1）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條； 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色； 4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果； 5）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高； 6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 7）標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。 4、免疫組化染色呈陰性結(jié)果 1）抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤； 2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)； 3）組織切片本身這種抗原含量低； 4）血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)； 5）DAB孵育時(shí)間過(guò)短； 6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)； 7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。 5、背景 1）考慮一抗?jié)舛雀撸?br /> 2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間； 3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短； 4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。 |
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