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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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兩種滲透性腹瀉動(dòng)物模型的構(gòu)建
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兩種滲透性腹瀉動(dòng)物模型的構(gòu)建 在我國(guó)，慢性腹瀉是嬰幼兒發(fā)病率很高的疾病，6個(gè)月至2歲的嬰幼兒發(fā)病率最高，1歲以內(nèi)約占50%，對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育及健康危害極大，已成為世界公共性衛(wèi)生問(wèn)題。慢性腹瀉病因復(fù)雜，包括過(guò)敏、感染、免疫缺陷、酶缺陷、藥物及先天畸形等，以急性感染性腹瀉未徹底治療、遷延不愈最為常見。從病理生理學(xué)角度，慢性腹瀉病還可細(xì)分為滲透性腹瀉、分泌性腹瀉、動(dòng)力障礙性腹瀉和炎癥性腹瀉，其中滲透性腹瀉在兒童中相對(duì)常見。 本次小助手講解兩種滲透性腹瀉模型的構(gòu)建方法，分別是檸檬酸鎂腹瀉（Mg）組以及乳糖腹瀉（Lac）組。 造模方法 選取SD大鼠，體質(zhì)量300g左右，雌雄各半。Lac組以高乳糖飼料喂養(yǎng)，飲用水采用滅菌純凈水；Mg組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，同時(shí)以檸檬酸鎂溶液代替滅菌純凈水飲用；Con組（正常組）以基礎(chǔ)飼料和滅菌純凈水喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由進(jìn)食和飲水。喂養(yǎng)15d，建立相應(yīng)慢性腹瀉模型。 腹瀉情況觀察 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均以單籠飼養(yǎng)，籠底墊鐵架，每日同一時(shí)間進(jìn)行體重、飲水量測(cè)量和大便觀察。觀察大便的性狀、顏色。對(duì)每只大鼠每天的稀便、干便進(jìn)行計(jì)數(shù)，用分規(guī)和刻度尺測(cè)量每一稀便污跡的直徑。以腹瀉率和腹瀉指數(shù)作為評(píng)判腹瀉的主要指標(biāo)。腹瀉指數(shù)＝稀便率×平均稀便級(jí)。稀便率＝每只動(dòng)物所排的稀便數(shù)÷該動(dòng)物總便數(shù)。稀便級(jí)表示每只動(dòng)物稀便的程度，以稀便的直徑分級(jí)，分為4級(jí)：＜1cm為1級(jí)，1～1.9cm為2級(jí)，2～3cm為3級(jí)，＞3cm為4級(jí)。平均稀便級(jí)＝所有稀便級(jí)數(shù)／稀便數(shù)。腹瀉率（％）＝腹瀉的動(dòng)物數(shù)／該組動(dòng)物總數(shù)×100％。 抓力和自主活動(dòng)度測(cè)試 抓力測(cè)試： 將腹瀉14d后的大鼠置于抓力測(cè)試儀上，當(dāng)它在被人為牽拉尾部向后移動(dòng)時(shí)會(huì)本能地抓住測(cè)試儀上的鐵架以克服后退，當(dāng)外界對(duì)其施加的拉力超過(guò)其自身的最大抓力時(shí)會(huì)被拉離抓力測(cè)試儀的鐵架，此時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)記錄抓力的最大值。每一只大鼠重復(fù)上述操作5次，每次測(cè)試之間讓其休息5s，取5次抓力的平均值。 自主活動(dòng)度測(cè)試： 測(cè)試前讓大鼠在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的房間適應(yīng)半天。測(cè)試開始時(shí)把大鼠放置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中央?yún)^(qū)，通過(guò)動(dòng)物行為分析系統(tǒng)觀察和分析其在曠場(chǎng)試驗(yàn)箱內(nèi)的活動(dòng)情況，每只大鼠測(cè)試10min，觀察指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)總路程和運(yùn)動(dòng)平均速度。測(cè)試均在下午1時(shí)到下午4時(shí)之間進(jìn)行。每次測(cè)試結(jié)束后，將大鼠放回籠內(nèi)，清洗曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底部和側(cè)壁，噴灑少量75％乙醇，待曠場(chǎng)試驗(yàn)箱干燥無(wú)異味后方可進(jìn)行下一只動(dòng)物的測(cè)試，每只大鼠測(cè)量1次。 跨腸上皮電阻測(cè)試 取2cm長(zhǎng)結(jié)腸中段，將腸腔內(nèi)黏液和腸內(nèi)容物用PBS溶液輕柔漂洗凈，避免損傷腸黏膜，然后將該段腸組織安裝在尤斯灌流室中的ussing chamber內(nèi)固定，膜兩側(cè)注入飽和的37℃Krebs液10ｍＬ（Krebs液：NaCl13.67ｇ、NaHCO3 4.2g和葡萄糖3.96g用雙蒸水1500mL溶解，加入STOCK液 100mL定容至 2000mL， 4 ℃ 保存。STOCK液的配制：CaCl2 5.56ｇ、KCl7.01ｇ、MgCl2·6H2O 4.88ｇ 和 NaH2PO4·2H2O 3.74g用雙蒸水900mL溶解，定容至1000mL，4℃保存），并且分別在灌流室兩側(cè)勻速通入5％CO2和95％Ｏ2組成的混合氣體，開始進(jìn)行腸黏膜跨腸上皮電阻檢測(cè)，每個(gè)樣本測(cè)試時(shí)間為1h。對(duì)每個(gè)樣本50～60min區(qū)間段的電阻值進(jìn)行積分，取同組大鼠腸黏膜跨腸上皮電阻平均值。 腸黏膜形態(tài)學(xué)的觀察 剖腹，取2cm小腸下段，2cm結(jié)腸中段。用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察腸黏膜病理學(xué)改變。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取4張不連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)垂直、完整的絨毛，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量絨毛高度和絨毛表面積（r為絨毛的半徑，h為絨毛的高度，單位以mm表示）。上述腸黏膜觀察與腸絨毛測(cè)量均在光鏡放大100倍下進(jìn)行。 總結(jié) 由腹瀉導(dǎo)致的新生兒死亡率高達(dá) 17％，對(duì)發(fā)展中國(guó)家5歲以下兒童的生命造成嚴(yán)重威脅，全球每年死于腹瀉病的兒童約有200萬(wàn)。腹瀉根據(jù)病程可分為急性腹瀉和慢性腹瀉，臨床上將腹瀉時(shí)間超過(guò)2周的統(tǒng)稱為慢性腹瀉。在我國(guó)，隨著生活環(huán)境的改善、生活水平的提高，急性腹瀉�。ㄌ貏e是急性重癥腹瀉）有所減少，但慢性腹瀉患兒比例卻有上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者調(diào)查表明嬰幼兒遷延性、持續(xù)性腹瀉約占腹瀉病的 62.6％。因此，研究慢性腹瀉的發(fā)病機(jī)制、藥物療效、營(yíng)養(yǎng)支持等具有較高的臨床價(jià)值。 |
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