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引物設(shè)計與驗證的注意事項
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前置知識 引物是一種短的DNA或RNA序列，用于在PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）和其他分子生物學技術(shù)中擴增和檢測特定的DNA或RNA序列。 引物通過與目標序列的互補堿基配對來定向擴增所需的DNA或RNA片段。在分子生物學研究中，引物的設(shè)計是非常重要的一步，因為它直接影響到PCR擴增的特異性和靈敏度。 一、普通PCR與熒光定量PCR引物設(shè)計上的相同注意點 1.序列的查找是一致的，在NCBI上搜索不同物種的同一基因，序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，選擇合適片段長度 2.引物長度（primer length）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度太高，不適合 DNA 聚合酶進行反應(yīng) 3.3’端最好不要有A，5’端可以容忍二聚體，但3’端一定不要有二聚體 4.不要有連續(xù)的GGG 或CCC、GCGC、CGCG之類，不要有錯配，前后引物的退火溫度要差不多，差異在2度以內(nèi) 5.避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu) 6.Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60% 7.引物之間的TM相差避免超過2℃ 8.引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基，引物3'端要避開密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 9.引物的設(shè)計好后使用Blast 驗證 各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如 GC 含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物； 用作克隆目的的 PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 如果實在滿足不了這么多要求，那么就： 1、引物與模板配對好； 2、兩個引物退火溫度差不多； 3、每個引物的 GC 含量不要太高或太低； 4 、引物最好沒有回文序列； 就這 4 點就很好了。如果還是滿足不了！只要前2點就夠了。 二、熒光定量引物的特定要求 做熒光定量PCR時，用SYBR Green I 法時的一對引物與一般 PCR 的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。 熒光定量PCR引物設(shè)計的要求： 1、避免重復堿基，尤其是 G. 2、引物的退火溫度要高，一般最好要在 60 度以上； 3、GC含量40-60%. 4、3'端最后 5 個堿基內(nèi)不能有多于 2 個的 G 或 C. 5、正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6、引物的產(chǎn)物大小不要太大，80～150 bp 最為合適。 三、引物設(shè)計后的NCBI BLAST引物驗證 BLAST 的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列； 如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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