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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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如何設(shè)計(jì)PCR引物
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5分鐘學(xué)會如何設(shè)計(jì)PCR引物 查找目的基因序列并不能直接用于我們研究所用，因?yàn)椴檎业降幕蛐蛄兄荒芩闶腔虻碾娮有蛄校⒉皇俏覀冄芯恳玫默F(xiàn)實(shí)中的序列，如何獲得現(xiàn)實(shí)的基因序列呢？這就需要我們根據(jù)基因的電子序列來設(shè)計(jì)引物了，通過引物借助PCR方法才能獲得我們的目的基因序列。接下來，我們將介紹一下PCR方法并講述如何設(shè)計(jì)引物。 PCR（polymerasechainreaction），即聚合酶鏈反應(yīng)，又稱基因體外擴(kuò)增技術(shù)，是由一對引物介導(dǎo)、能在體外對特定DNA片段進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增的技術(shù)。PCR能把很微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬倍達(dá)到檢測水平．使原來無法進(jìn)行分析和檢測的許多項(xiàng)目得以完成。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。 1、 引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。 2、 避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。 3、 長度 寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因?yàn)?gt;38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。 4、 G+C含量 G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。 5、 堿基隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 6、 引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 7、 引物之間 兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 8、 引物的3′端 引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。 9、 引物的5′端 引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 10、 密碼子的簡并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增特異性與效率。 |
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