 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1672 | 回復: 0 | ||
科研蟲子小助手新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
干貨分享 | 活性氧ROS的流式檢測
|
|
活性氧（ROS）的流式檢測通常是通過使用熒光探針如DCFH-DA來監(jiān)測細胞內活性氧水平的變化。以下是該檢測方法的一些關鍵步驟和原理： 0 1 選擇熒光探針 常用的熒光染料是DCFH-DA，它能夠進入細胞并在細胞內被酯酶水解成DCFH。DCFH隨后可以被細胞內的活性氧氧化，生成發(fā)熒光的DCF。 0 2 DCFH-DA 是一種用于檢測活性氧ROS的熒光探針，全稱為2,7-二氯熒光素二乙酸酯。其工作原理為：DCFH-DA本身沒有熒光，但可以自由穿過細胞膜，一旦進入細胞，它會被細胞內的酯酶水解成DCFH，由于DCFH無法穿過細胞膜，因此熒光探針會在細胞內積聚。細胞內的ROS能夠氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備，在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光信號。 0 3 步驟 裝載探針 對于刺激時間較短(通常為2小時以內)的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。 原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。通�；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎�20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 收集細胞后裝載探針：按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通�；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎�20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。 檢測 對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。 參數(shù)設置 使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設置檢測DCF。 0 4 流式方法檢測需客戶提供的資料 1.實驗細胞 2.刺激藥物 實驗流程 細胞培養(yǎng)——加藥刺激——細胞標記——流式上機檢測——結果分析 結果 1.流式原始數(shù)據(jù) 2.數(shù)據(jù)分析結果 3.實驗報告，包括儀器，試劑及實驗步驟 |
回復此樓
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 科研蟲子小助手 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 281求調劑 +5 | Koxui 2026-03-12 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料工程調劑 +3 | 咪咪空空 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 2026考研求調劑-材料類-本科211一志愿985-初試301分 +10 | 蟲友233 2026-03-07 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 研究生招生 +3 | 徐海濤11 2026-03-10 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +5 | 18880831720 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 308求調劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 081200計算機科學與技術數(shù)一英一306求調劑 +3 | intankt 2026-03-08 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程307，求調劑 +7 | 我要燃燒你的夢 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 哈工大材料324求調劑 +6 | 閆旭東 2026-03-10 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 化工0817調劑 +8 | 燦若星晨 2026-03-10 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 調劑 +5 | 調劑的考研學生 2026-03-09 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調劑 +8 | 小木蟲085600 2026-03-09 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 308求調劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調劑！ +3 | 朔朔話 2026-03-09 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工 一志愿山大 321分 求調劑 +6 | 每天散步 2026-03-09 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 2026博士申請 +6 | 起泡酒 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0817找調劑 +6 | kk扛 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調劑 +4 | 邱gl 2026-03-06 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 08工科求調劑 +3 | 隆LLL 2026-03-06 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 復試調劑 +5 | 呼呼？~+123456 2026-03-05 | 5/250 |
|