 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 500 | 回復(fù): 0 | |||
科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
|
[交流]
蛋白實(shí)驗(yàn) | 免疫共沉淀
|
|
蛋白實(shí)驗(yàn) | 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種利用抗原與抗體之間的專一性為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典研究方法。 原理 如果細(xì)胞內(nèi)兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將A蛋白沉淀下來，在細(xì)胞內(nèi)與A蛋白直接相互作用的B蛋白或與其間接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下來。使用western blot檢測沉淀中是否存在B或C蛋白來確定B或C蛋白與A蛋白的相互作用。 用途 1、檢測A、B蛋白在體內(nèi)是否相互結(jié)合 2、分離與A蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn)： （1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。 步驟 一、細(xì)胞的鋪板與轉(zhuǎn)染 1、提前一晚將293T細(xì)胞鋪板至6 cm皿中，鋪板量以達(dá)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑要求為準(zhǔn)； 2、用各實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染兩皿細(xì)胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質(zhì)粒2微克。 二、免疫沉淀 1、轉(zhuǎn)染24小時后，收獲細(xì)胞，每皿加入500 μL裂解液，收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細(xì)胞； 2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心30分鐘，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作總蛋白并加入等體積的2Ⅹ loading buffer； 3、將400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗體，4℃孵育 3-4 小時； 4、4℃，2,000 rpm，離心3分鐘，去除未結(jié)合的液體，留下beads沉淀，用預(yù)冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分鐘； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。 三、Western Blot 檢測 通過 SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對照，檢測flag-A和HA-B蛋白是否發(fā)生結(jié)合。 注意事項(xiàng) 1、對于內(nèi)源的Co-IP檢測應(yīng)該用10cm皿來培養(yǎng)目的細(xì)胞，并維持較好的生長狀態(tài)； 2、如果該實(shí)驗(yàn)用于新蛋白的鑒定，應(yīng)注意抗體重鏈和輕鏈的影響； 3、該實(shí)驗(yàn)不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有171人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研戰(zhàn)神·王 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600 材料與化工 298 +11 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 11/550 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | Y?l?h 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料與化工281求調(diào)劑，有科研和獲獎經(jīng)歷 +9 | wsxw 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
[考博] 26申博 +5 | north， 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿西工大材料學(xué)，英一數(shù)二總分321分，求調(diào)劑。 +3 | zz05zz 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 347求調(diào)劑 +3 | 啊歐歐歐 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請] 請問大家，研究風(fēng)險與應(yīng)對措施那里， 大家都怎么寫呢 ？ +3 | cauasen 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | Guo_yuxuan 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 化工270求調(diào)劑 +10 | 什么名字qwq 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[論文投稿]
通訊作者寫誰，問題是你意想不到的問題
 15+3
|
阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 【2026 碩士調(diào)劑】課題組 招收調(diào)劑生 +3 | 考研版棒棒 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +11 | yunziaaaaa 2026-03-01 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | repeatt?t 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600材料工程一志愿中科大總分312求調(diào)劑 +9 | 吃宵夜1 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 306分材料調(diào)劑 +5 | chuanzhu川燭 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料與化工328求調(diào)劑 +3 | 。，。，。，。i 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +10 | 天下熯 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +3 | aaadim 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[論文投稿]
Optics letters投稿被拒求助
30+3
|
luckyry 2026-02-26 | 4/200 |
|