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專業(yè): 實驗動物學

[交流] RNA反轉錄

為了研究RNA的功能，通常需要通過反轉錄過程將RNA轉化為更穩(wěn)定的互補DNA（cDNA）。之后cDNA可通過分子克隆、PCR和測序等技術做進一步的研究。因此，反轉錄過程是許多RNA實驗研究流程的關鍵步驟。

為了獲得更為準確的研究結果，本期總結了反轉錄過程中需要考慮的一些因素，以期能夠拋磚引玉，給你的實驗研究帶來些許幫助。

本期內容

● RNA模板制備

● 基因組DNA的去除

● 反轉錄酶選擇

● 引物選擇

● 主要反應組分

● 反應溫度和反應時間

● 第一鏈和第二鏈cDNA合成

一、RNA模板制備

RNA是反轉錄的模板�？俁NA通常用于RT-(q)PCR等下游應用的cDNA合成，而特定類型的RNA（如信使RNA（mRNA）、miRNA等小RNA）可通過富集而用于某些實驗應用，如cDNA文庫構建和miRNA圖譜分析。

保持RNA的完整性至關重要，在提取、處理、儲存和實驗過程中均需要采取特殊的保護措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有氣溶膠屏障的移液器移液、使用無核酸酶的實驗室器具和試劑以及對實驗區(qū)域進行去污處理。

根據來源材料（如血液、組織、細胞、植物）的類型和實驗目標，有多種RNA分離和純化方法可供選擇。分離純化過程的主要目標是穩(wěn)定RNA分子、抑制RNA酶，并通過適當?shù)膬Υ婧吞崛》椒ㄗ畲蟪潭忍岣弋a量。最佳的純化方法可以去除干擾酶活性的內源性化合物，如植物組織中的復合多糖和腐殖酸，以及反轉錄酶的常見抑制劑，如鹽、金屬離子、乙醇和苯酚。純化的RNA應保存在-80°C，盡量減少反復凍融。

純化后評估RNA質量和數(shù)量的方法有許多種。常用的方法是利用紫外光譜法檢測特定波長的吸光度。RNA質量可通過利用Beer-Lambert定律測定260 nm處的吸光度而確定；不同波長的吸光度比值可以確定是否存在特定污染物（表1）。請注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波長的紫外線。對于需要更高RNA特異和更靈敏分析的RNA, 可以考慮使用含染料的熒光試劑，這種試劑只在特異性的與目標分子結合時才會釋放熒光信號。

以28S和18S核糖體RNA（rRNA）的比值可評估RNA的完整性。將總RNA變性后進行凝膠電泳，可對其進行定性評估。然后，評估28S rRNA與18S rRNA的強度比，比值為2:1代表完整的RNA（圖1A）。Agilent Technologies開發(fā)的一種方法結合了微流體學和專利算法，可定量評估RNA的完整性。該方法可產生數(shù)字讀數(shù)，稱為RNA完整性分數(shù)或RIN值，數(shù)值介于8至10之間代表高質量的RNA [1,2]（圖1B）。

二、基因組DNA的去除

某些情況下，痕量基因組DNA（gDNA）可能與RNA共同被純化。污染gDNA可能會干擾反轉錄結果，導致RT-qPCR等高靈敏度實驗出現(xiàn)假陽性、高背景或檢測率降低。

為去除gDNA，通常在RNA分離過程中加入DNase I。在進行RT-(q)PCR之前，必須完全去除DNase I，因為任何殘留的酶都會使單鏈DNA（如引物和cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加熱處理）或酶去除步驟會導致RNA降解或樣品損失。

作為DNase I的替代品，可使用雙鏈特異性DNase去除污染gDNA，而不影響RNA或單鏈DNA。它們的熱分解性質使其在相對溫和的溫度（如55℃）下即可失活，同時沒有負面影響。在反轉錄反應之前，只需將這種雙鏈特異性DNase與RNA在37℃下孵育2分鐘，從而簡化實驗流程（圖2）。

三、反轉錄酶選擇

反轉錄酶以RNA為模板合成cDNA，但這一類反轉錄酶可能具有不同的功能活性和性質。它們的性質會影響其反轉錄長鏈RNA、高GC含量RNA、具有復雜二級結構的RNA和不純RNA的能力。

分子生物學中使用的大多數(shù)反轉錄酶來源于禽成髓細胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。AMV反轉錄酶是實驗室中首批用于cDNA合成的酶之一。該酶是一種分子量為170-kDa的異二聚體，最佳反應溫度范圍為42-48℃。AMV反轉錄酶具有較強的RNase H活性，可降解RNA:cDNA復合物中的RNA，獲得的cDNA片段較短（<5 kb）。

MMLV反轉錄酶因具有單體結構而成為常用的替代品，可對重組酶進行更簡單的克隆和修飾。MMLV反轉錄酶是一種分子量為75 kDa的酶，反應溫度約為37°C。雖然MMLV的熱穩(wěn)定性低于AMV反轉錄酶，但其RNase H活性較低，因此具有更高的長cDNA（<7kb）合成效率[3]。

為了進一步改善cDNA合成，MMLV反轉錄酶經過改造具有更低的RNase H活性（即RNase H Minus，將RNase H結構域進行突變）、更高的熱穩(wěn)定性（高達55℃）和更強的持續(xù)合成能力（65倍以上）。這些屬性改變可增加cDNA長度和產量，提高靈敏性，改善抑制劑耐受性，并縮短反應時間（表2）[4]。

四、引物選擇

為了啟動反轉錄，反轉錄酶需要一種短DNA寡核苷酸（即引物）與其互補序列在RNA模板上結合，并作為新鏈合成的起點。根據RNA模板和下游應用，有三種基本類型的引物可供選用：oligo（dT）引物、隨機引物和基因特異性引物（圖3）。

❖ Oligo（dT）引物由12-18個脫氧胸腺核苷酸組成，可與真核mRNA的poly(A) 尾退火。其為從真核生物mRNA構建cDNA文庫、全長cDNA克隆和cDNA 3'末端快速擴增（3'RACE）的最佳選擇。由于oligo(dT)引物對poly(A) 尾的特異性，其不適用于降解的RNA，如來自FFPE樣品的RNA，也不適用于缺少poly(A) 尾的RNA，如原核生物RNA和microRNA。由于cDNA合成開始于3' poly（A）尾，oligo(dT)引物可能引起3'末端偏差。具有復雜二級結構的RNA也可能影響全長cDNA合成，導致5'末端的代表性偏低。

通過修飾Oligo(dT)引物，可以提高反轉錄效率。例如，Oligo(dT)引物的長度可以延伸到20個核苷酸或更長，使其在較高溫度下退火。在一些情況下，Oligo(dT)引物可能包括3'末端的多義堿基，如dN（dA，dT，dG或dC）和dV（dG，dA或dC）。該修飾可防止poly(A)滑移，并且將起始位點鎖定在poly(A)尾的上游位置。這些引物被稱為錨定oligo(dT)。

❖ 隨機引物是具有隨機堿基序列的寡核苷酸，通常由6個核苷酸組成，被稱為隨機六聚體、N6或dN6。由于隨機引物的隨機結合（即沒有模板特異性），其可以退火到樣本中的任何類型RNA。因此，這些引物被認為可以用于無poly（A）尾結構（如rRNA、tRNA、非編碼RNA、小RNA、原核mRNA）的RNA、降解RNA（如來自FFPE組織的RNA）和具有已知二級結構的RNA（如病毒基因組）的反轉錄。

雖然隨機引物有助于改善cDNA合成，但它們不適合用于長RNA的全長反轉錄。增加隨機六聚體引物的濃度可提高cDNA產量，但同時也會增加相同模板上與多個位點的結合，從而導致cDNA片段較短。

此外，隨機引物可能不適用于某些RT-PCR應用。例如，高估m(xù)RNA拷貝數(shù)就是一個需要考慮的問題[5]。兩步法RT-PCR經常使用oligo(dT)和隨機引物的混合物，結合每種類型引物的優(yōu)點。在microRNA（miRNA）表達檢測中，隨機六聚體并不適用，必須為miRNA的反轉錄設計特殊引物[6,7]。

使用oligo (dT)引物和不同濃度的隨機六聚體引物，將具有poly(A)尾的6.4 kb RNA反轉錄成雙鏈cDNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析結果可以看到，使用oligo（dT）引物可獲得更分散、更長的轉錄產物，相比之下，增加隨機六聚體的濃度，可產生更高濃度的短cDNA。

❖ 基因特異性引物可提供特異性最強的反轉錄引物配對。這些引物是根據目標RNA的已知序列進行設計的。由于引物與特異性RNA序列結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當對多種目標進行分析時，則需要使用更多的RNA樣本�；蛱禺愋砸锿ǔＳ糜谝徊絉T-PCR實驗應用。

五、主要反應組分

除了反轉錄酶和引物之外，其它主要反應組分還包括RNA模板（預處理以去除基因組DNA）、緩沖液、dNTP、DTT、RNA酶抑制劑和RNase-free水。

❖ RNA模板按本文前述方法制備。表4提供了反轉錄反應的推薦RNA起始量范圍，最佳起始量取決于目標序列的普遍性和反轉錄酶的靈敏性。

表4. 反轉錄反應的推薦RNA起始量范圍

❖ 反應緩沖液可維持反應的最佳pH和離子強度。提供的緩沖液還可能含有提高反轉錄效率的添加劑。

❖ dNTPs通常為0.5-1 mM，最好為等摩爾濃度。推薦使用新鮮稀釋的高品質dNTP，以確保良好的反轉錄效果。

❖ DTT，一種還原劑，通常用于提供最佳的酶活性。如果DTT或其他添加劑發(fā)生沉淀，會降低反應效率；因此，應溶解反應組分并充分混勻。

❖ RNA酶抑制劑通常包含在反應緩沖液中或單獨被添加到反轉錄反應中，用于防止RNA降解。RNase可能在RNA分離過程中被共同純化，或者在反應體系配制期間被引入。已知的RNase有許多種，應根據其作用方式和反應要求選擇合適的RNA酶抑制劑。

❖ 反轉錄反應中使用的水應不含有核酸酶。最好選用商業(yè)化供應的無核酸酶水，或經DEPC（焦碳酸二乙酯）處理去除RNase的水。污染RNase不能通過簡單的過濾去除，而且由于RNase是熱穩(wěn)定的，無法通過高壓消毒去除。

六、反應溫度和反應時間

反轉錄反應包含三個主要步驟：引物退火、DNA聚合和酶失活（圖6）。這些步驟的溫度和持續(xù)時間因選擇的引物、目標RNA和使用的反轉錄酶而異。

圖6. cDNA合成的三個主要步驟。

❖ 引物退火：將引物與RNA模板混合，加熱至65℃并維持5分鐘，然后冰浴至少1分鐘。這有助于確保RNA保持單鏈以及引物與靶標有效退火。退火后，加入反轉錄酶和必需組分（如緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑）。

❖ DNA聚合：在此步驟中，反應溫度和持續(xù)時間可能會根據所使用的引物和反轉錄酶而變化。使用oligo (dT)引物（Tm〜35-50 ℃），可以在反轉錄酶的最佳反應溫度（37-50 ℃）下直接孵育反應。隨機六聚體引物因其較短的長度，通常具有較低的Tm（〜10-15℃）。因此，當使用隨機六聚體引物（單獨使用或與oligo（dT）結合使用）時，我們建議在加入酶后，在室溫（〜25℃）孵育10分鐘以延伸引物。

反轉錄酶的熱穩(wěn)定性各不相同，而熱穩(wěn)定性決定了每種酶的最佳聚合溫度。使用熱穩(wěn)定的反轉錄酶，可達到更高的反應溫度（如50 ℃），有助于高GC或具有復雜二級結構RNA的變性，同時不影響酶活性（圖7）。

聚合時間取決于反轉錄酶的持續(xù)合成能力，即單次合成過程中摻入的核苷酸數(shù)量。例如，持續(xù)合成能力較低的野生型MMLV反轉錄酶通常需要60多分鐘才能完成cDNA合成。相比之下，持續(xù)合成能力較高的改良型反轉錄酶可能只需要10分鐘時間，就可以合成9 kb cDNA。

圖片

圖7. 熱穩(wěn)定性對反轉錄酶活性的影響。使用oligo（dT）引物和放射性標記dNTPs，對含有不同長度RNA的樣本進行反轉錄。通過凝膠電泳分離反應產物，并通過放射自顯影進行顯色。熱穩(wěn)定的反轉錄酶即使在50℃以上也能得到高cDNA產量。

❖ 酶失活：反轉錄反應的最后一步是將反轉錄酶失活處理。失活溫度范圍為70-85 ℃，具體取決于酶的熱穩(wěn)定性。失活通常需要5-15分鐘，溫度越高，所需時間越短。

七、第一鏈和第二鏈cDNA合成

如前所述，從RNA模板合成cDNA，產生cDNA:RNA復合物。該過程被稱為第一鏈cDNA合成。如果存在RNase H活性（如野生型AMV和MMLV反轉錄酶），則cDNA:RNA復合物中的RNA會在第一鏈合成期間被切割。第一鏈cDNA可以直接用于RT-PCR等實驗應用中，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）將復制cDNA的互補鏈。

在cDNA文庫構建和測序中，將第一鏈cDNA作為模板，獲得代表RNA靶標的雙鏈cDNA。這個過程被稱為第二鏈cDNA合成。在第二鏈cDNA合成中，推薦使用RNase H活性最小的反轉錄酶，從而最大限度地增加cDNA合成長度和產量。

雙鏈cDNA的合成可以使用多種DNA聚合酶（如T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶）生成cDNA第一鏈的互補鏈。以下列舉的一些其它酶也可按照Gubler-Hoffman改良方法[8]（圖8）用于雙鏈cDNA合成。

圖片

圖8. 利用Gubler-Hoffman方法進行雙鏈cDNA合成。

❖ E. coli RNase H切割cDNA:RNA復合物中的RNA鏈，為DNA合成提供3'-OH引物結合位點

❖ E. coli DNA polymerase I利用5′-3′'聚合酶活性延伸切口RNA鏈，并利用5'-3'外切核酸酶活性沿合成方向替換RNA鏈，該過程被稱為切口平移。

❖ E. coli DNA ligase縫合新合成cDNA片段之間的切口。（T4 DNA連接酶不能用作替代物，因為它會連接鈍端雙鏈cDNA片段并形成嵌合結構。）

❖ T4 DNA polymerase可將雙鏈cDNA的末端平端化（最后一步，可選）。

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1樓 2023-11-21 11:09:52

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