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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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免疫熒光教程
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1、細(xì)胞準(zhǔn)備 （1）取出生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，消化重懸細(xì)胞。 （2）將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。 （3）根據(jù)細(xì)胞生長特性取適量細(xì)胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培養(yǎng)。 2、固定 （1）取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞3次。 （2）每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min，棄去多聚甲醛； （3）加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)兩次。 3、通透 （1）每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室溫10min，棄去Triton-X100。 （2）加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)兩次。 4、封閉 每孔中加入1mL的3%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄封閉液。 5、一抗結(jié)合 （1）向爬片上滴加稀釋好的一抗，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24 孔板放置于4℃冰箱中，過夜孵育。 （2）加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)五次。 6、二抗結(jié)合 （1）加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。 （2）加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)五次。 7、DAPI染色 （1）按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液（參照廠家說明書），并向每個(gè)孔中加入1mL的DAPI工作液，避光靜置染色10min。 （2）加入1mL的PBS清洗細(xì)胞，5min，棄PBS。重復(fù)三次。 8、封片及檢測 （1）將爬片小心取出，用吸水紙吸干多余液體，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。 （2）將爬片倒置載玻片上，周圍涂指甲油固定。 （3）4℃暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。 |
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