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線粒體靶向抗氧化肽SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性的保護作用
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[摘要] 目的 探討線粒體靶向抗氧化肽SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性的影響及其機制。方法 40只12周齡SD大鼠（雌雄各半，體質量約220 g）分成5組（n=8）：假手術組（只開腹，不結扎盲腸和穿孔）、膿毒癥組（盲腸結扎穿孔術制作膿毒癥模型）、常規(guī)治療組（conventional treatment，CT組，膿毒癥模型12 h后，股靜脈輸注LR）、SS-31早期治療組（常規(guī)治療基礎上在盲腸結扎穿孔前30 min尾靜脈給予SS-31 3 mg/kg）和SS-31晚期治療組（常規(guī)治療基礎上在盲腸結扎穿孔12 h后從股靜脈輸注LR聯(lián)合SS-31）。通過熒光蛋白透過率的方法測定大鼠肺臟和腎臟的血管通透性，伊文思藍染色透過率檢測大鼠腸道通透性；離體取原代肺靜脈內皮細胞觀察LPS刺激（LPS組）及SS-31預處理（SS-31預處理組）后對內皮細胞的閉鎖小帶蛋白1（zonula occludes-1，ZO-1）的表達和細胞跨膜電阻（trans electric resistance，TER），以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影響，以無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的細胞作為正常對照組。結果 ① 與假手術組比較，膿毒癥組大鼠肺臟、腎臟血管以及腸道組織的通透性明顯增加，線粒體功能降低（P < 0.01）；采用常規(guī)治療（LR聯(lián)合頭孢呋辛鈉和多巴胺同時輸注）盡管可以降低膿毒癥大鼠的通透性和減輕線粒體功能損害，但與膿毒癥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；SS-31治療可明顯降低膿毒癥大鼠肺臟、腎臟血管以及腸道組織的通透性和增加線粒體功能，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），其中SS-31早期治療效果比晚期治療效果更好。②與正常對照組比較，LPS組ZO-1表達明顯降低，細胞結構排列紊亂，TER明顯降低，ROS含量增加；SS-31預處理可使ZO-1表達增加，細胞間連接緊密，TER明顯增加，ROS含量明顯降低。結論 SS-31對膿毒癥大鼠的血管通透性有保護作用，其機制可能與抑制線粒體氧化應激有關。 膿毒癥是指機體對感染的反應失調而致的危及生命的器官功能障礙，是嚴重創(chuàng)傷、燒傷后的常見并發(fā)癥和主要死亡原因之一。據統(tǒng)計全球每年有2 100萬膿毒癥患者，死亡率高達20%~50%[1]。多數膿毒癥患者存在嚴重的血管滲漏，目前認為血管滲漏是膿毒癥主要的病理生理變化之一，可引起組織水腫甚至器官功能障礙，嚴重時可危及生命。氧化應激損傷被認為是重要的發(fā)病機制之一。氧化應激是指機體遭受各種有害刺激后，體內的活性自由基產生過多，氧化作用遠遠超出了機體對氧化物的清除能力，從而產生大量的氧化中間產物，導致炎性細胞浸潤和組織損傷。研究表明，缺血再灌注損傷會引起氧化應激，可導致大腦、心臟等重要器官功能損傷[2]，動脈粥樣硬化、糖尿病[3-4]等。針對氧化應激的發(fā)生機制提出了相應的抗氧化應激治療措施，但效果仍不理想。 SS-31是一種新型的線粒體靶向抗氧化劑，由加拿大教授Szeto和Schiller發(fā)現(xiàn)并命名，主要分布在線粒體內膜上，可直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），已發(fā)現(xiàn)SS31靶向線粒體并保護神經元免受Ca2+誘導的線粒體腫脹。以往研究表明，SS-31對缺血再灌注心臟、阿爾茲海默癥、糖尿病等有很好的保護作用[5-7]，但SS-31對膿毒癥血管通透性是否也有保護作用不清楚。為此，本研究采用盲腸結扎穿孔術復制大鼠膿毒癥模型，觀察SS-31早期和晚期治療對膿毒癥大鼠血管通透性的保護作用，并初步探討其保護機制。 1 材料與方法 1.1 試劑 實驗試劑有：SS31，DArg-Dmt-Lys-Phe-NH2，相對分子質量639.8 g/mol，規(guī)格100 mg，溶于生理鹽水，配成濃度為1 mg/mL；異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白（albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate，F(xiàn)ITC-BSA）購自美國Sigma公司，貨號A9771，使用濃度9 mg/kg；伊文思藍（Evans blue）購自Sigma公司（美國），規(guī)格100 g，用生理鹽水配制濃度為1.5%；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Sigma公司（美國），貨號L2630，用PBS配制成濃度為10 mg/mL；ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所（中國）；閉鎖小帶蛋白1（zonula occludes-1，ZO-1）抗體購自中國博士德公司，兔抗大鼠，一抗?jié)舛?:200；2, 6-二異丙基苯胺（2, 6-Diisopropylaniline，DAPI）購自中杉金橋公司（中國）。 1.2 大鼠膿毒癥模型制備 取12周齡SD大鼠40只，雌雄各半，體質量220 g左右[陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（渝）20170002，使用許可證號為SYXK（渝）20170002]。根據文獻[8]方法用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔麻醉，碘酒消毒腹部，沿腹直線剪開腹部，切口約3 cm，暴露盲腸，將糞便充盈至盲端，距盲端0.7 cm處結扎、穿孔，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，使糞便流入腹腔，引起感染，復位盲腸，離斷兩側大網膜，縫合傷口，按2 mL/100 g大鼠腹腔注射無菌生理鹽水，大鼠放回籠子，禁食不禁水，用于后續(xù)實驗。 1.3 實驗分組 大鼠分成5組：假手術組、膿毒癥組、常規(guī)治療組（conventional treatment，CT）、SS-31早期治療（Ear）組和SS-31晚期治療（Lat）組。假手術組只開腹，不結扎盲腸和穿孔；膿毒癥組：用盲腸結扎穿孔術制作膿毒癥模型；常規(guī)治療組：在膿毒癥模型12 h后，股靜脈輸注LR（含頭孢呋辛鈉和多巴胺），輸注3 h后，MAP>65 mmHg；SS-31早期治療組：在盲腸結扎穿孔前30 min尾靜脈給予SS-31（3 mg/kg），在膿毒癥模型12 h后，輸注LR 3 h（含頭孢呋辛鈉和多巴胺）；SS-31晚期治療組：在盲腸結扎穿孔12 h后從股靜脈輸注LR（含頭孢呋辛鈉和多巴胺）聯(lián)合SS-31（3 mg/kg），輸注3 h。輸注完成后檢測大鼠的肺臟、腎臟和腸道通透性以及線粒體功能。 培養(yǎng)肺靜脈內皮細胞，分成正常對照組、LPS組、SS-31預處理組。正常對照組：實驗前1 d用無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；LPS組：用無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用2 mg/mL的LPS刺激12 h；SS-31預處理組：用無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入0.1 μg/mL SS-31預刺激30 min，再加入LPS刺激12 h。檢測內皮細胞的ZO-1、跨膜電阻（trans electric resistance，TER）和ROS。 1.4 實驗方法 1.4.1 肺臟和腎臟通透性檢測 大鼠麻醉后固定，經頸靜脈插管注射FITC-BSA (9 mg/kg)，2 h后經頸靜脈注射稀肝素40 mL開始沖洗，結扎腹主靜脈，剪斷腹主動脈，沖洗至肺臟和腎臟變白，取左肺上葉和整個左腎，稱量，剪碎肺組織，勻漿，8 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，用熒光分光光度計測定組織的光密度(波長500 nm，530 nm)，同時使用多功能酶標儀測定組織勻漿液的光密度，并計算勻漿液中熒光白蛋白濃度和總蛋白濃度。以組織上清液熒光白蛋白濃度/總蛋白濃度代表肺臟和腎臟的血管通透性。 1.4.2 腸道通透性檢測 腸道通透性測定通過伊文思藍通透率法。各組大鼠處理完畢后斷頭處死，在距離胃幽門約6 cm處取1段約6 cm長的小腸，用預熱的PBS輕輕沖洗腸腔，將小腸的一端結扎，從另一端注入200 μL濃度為1.5%的伊文思藍，并將其結扎，制成腸囊。將腸囊置于37 ℃水浴中2 h后，用PBS沖洗至澄清，然后將腸組織在50 ℃烤箱中烤24 h，取出稱取腸干質量，后加2 mL甲酰胺溶液放置于37 ℃ 24 h，取溶液在分光光度計上測定波長655 nm處光密度值[D（655）]，并計算出每克腸含伊文思藍的質量（mg/g）。 1.4.3 原代內皮細胞提取 正常SD大鼠麻醉后，腹腔注射肝素鈉，10 min后打開胸腔，分離左、右兩側肺靜脈，置于無菌PBS中，縱向剖開肺靜脈血管，并剪成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，PBS多次清洗組織，將肺靜脈內面貼于培養(yǎng)瓶，加入DMEM-F12完全培養(yǎng)基，待組織完全干燥后，使培養(yǎng)基浸沒組織塊，37 ℃孵箱中培養(yǎng)3 d，所得細胞經鑒定為內皮細胞[9]，取3~5代內皮細胞用于實驗。 1.4.4 TER測定 接種1×105/mL細胞于Transwell小室中，經2~3 d待細胞單層長滿后，用跨膜電阻測定儀EVOM2（美國World Precision Instruments公司）測量，垂直插入電極到Transwell中，長電極插入下腔，短電極在上腔，待電阻值穩(wěn)定后記錄數值，重復測定3次，取平均值。內皮細胞的電阻值為（實測電阻值－空白電阻值）×Transwell有效膜面積，單位為Ω·cm2。 1.4.5 免疫熒光檢測ZO-1 取3~5代處理后的肺靜脈內皮細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton破膜1 min，1%BSA封閉10 min，一抗4 ℃過夜，二抗常溫避光孵育1 h，DAPI避光孵育10 min，每一步驟均要用PBS洗3次，每次5 min。激光共聚焦顯微鏡觀察（激發(fā)波長：488 nm，發(fā)射波長：535 nm）ZO-1的表達。 1.4.6 線粒體的呼吸控制率測定 取大鼠的腎臟和小腸組織5 g，用PBS洗干凈血漬，放入20 mL冰冷的分離緩沖液中（蔗糖0.25 mol/L，Na2EDTA 0.1 mmol/L，Tris 0.01 mol/L，pH=7.6）勻漿，將組織勻漿液在4 ℃以1 600×g離心12 min，將上清液在4 ℃以25 000×g離心15 min，收集沉淀并重懸于1 mL分離緩沖液中，并通過文獻[10]中Lowry法測量線粒體蛋白濃度；將1.4 mL測量緩沖液（Tris 0.2 mol/L，pH 7.6，KCl 15 mmol/L，KH2PO4 15 mmol/L，Na2EDTA 1 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，蔗糖0.25 mol/L）加熱至30 ℃，將反應混合物加入反應室中并平衡2 min，然后將0.2 mL 3 mg/mL線粒體混合物加入反應室中并平衡20 s，依次加入10 μL 0.5 mol/L蘋果酸鈉（C4H4Na2O5·H2O）和谷氨酸鈉（C5H8NNaO4）和5 μL ADP（400 nmol/L）。通過線粒體溶氧儀（MT 200，Stranthkelvin，蘇格蘭）測定耗氧率。呼吸控制率（有和沒有ADP的消耗氧氣率）反映了線粒體功能。 1.4.7 肺靜脈內皮細胞ROS測定 細胞密度長至90%時消化接種至共聚焦培養(yǎng)皿，待細胞長至適合密度，按照1:500加入DCFH-DA于無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃孵箱中孵育30 min，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度（波長488 nm），以熒光強度表示細胞中ROS含量。 1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，數據以x±s表示，兩組均數比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。 2 結果 2.1 SS-31對膿毒癥大鼠腎臟、肺臟血管和腸通透性的影響 與假手術組比較，膿毒癥大鼠的腎臟、肺臟血管和腸道通透性均顯著增加（P < 0.01）；常規(guī)治療可輕微降低腎臟、肺臟血管和腸道的通透性，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；SS-31治療可明顯降低腎臟、肺臟血管和腸道的通透性，與常規(guī)治療組比較，SS-31早期治療組分別降低了31%、36%和56%，SS-31晚期治療分別降低了12%、21%和48%，其中，SS-31早期治療效果更好，與常規(guī)治療組比較，有顯著性差異（P < 0.01，圖 1）。 圖片 2.2 SS-31對內皮細胞屏障的保護作用 利用免疫熒光檢測ZO-1的表達，觀察細胞連接，結果顯示，未經LPS刺激的內皮細胞間連接緊密，完整，且表達較多；LPS刺激12 h后，細胞間連接呈明顯的斷裂、碎片，且表達降低；而SS-31預處理后細胞形態(tài)恢復，細胞間連接緊密（圖 2A）；ZO-1蛋白表達結果顯示，LPS刺激后ZO-1蛋白表達降低(P < 0.01)，SS-31可以增加LPS所致的ZO-1的降低(P < 0.01，圖 2C、D）；TER結果顯示：與正常對照組比較，LPS刺激后，TER隨著測定時間延長逐漸降低(P < 0.01)，而SS-31早期治療可增加LPS刺激引起的TER降低(P < 0.01，圖 2B）。 圖片 2.3 SS-31對膿毒癥大鼠腎臟和腸道線粒體功能的影響 膿毒癥后大鼠的腎臟和腸道線粒體功能均顯著降低（P < 0.01），表現(xiàn)為膿毒癥組的腎臟和腸組織的線粒體呼吸控制率降低；CT治療對腎臟和腸組織的線粒體功能改善不明顯（P>0.05）；SS-31可明顯恢復腎臟和腸的線粒體功能，不管是早期治療還是晚期治療，其作用顯著好于CT治療組。其中SS-31早期治療效果最為明顯，大鼠腎臟和腸道的線粒體功能分別恢復到正常水平的97%和92%（圖 3）。 圖片 2.4 SS-31對內皮細胞ROS的影響 正常內皮細胞中產生ROS較少，綠色熒光較弱；LPS刺激后內皮細胞熒光強度明顯增強，SS-31可減弱LPS引起的熒光增強（圖 4）。綠色熒光強弱反映了ROS產生的多少。 圖片 3 討論 膿毒癥是感染引起的以全身炎癥反應為特征的臨床重癥，可導致多器官功能障礙，血管滲漏是膿毒癥的病理生理變化特征之一，嚴重影響著膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程。盡管對血管滲漏研究較多，但尚未完全闡明其發(fā)生機制，尚缺乏有效的治療措施，因此有效的治療藥物對膿毒癥血管滲漏至關重要。 膿毒癥時，重要器官線粒體功能障礙，而線粒體是細胞能量的加工廠，在機體能量生成、細胞內Ca2+調節(jié)、自由基產生、信號轉導和細胞凋亡調節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用，同時線粒體也是產生活性氧的主要場所。線粒體功能障礙嚴重影響著疾病的發(fā)生發(fā)展過程，有研究表明，線粒體功能障礙時產生的ROS增加、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成減少嚴重影響著高血壓的發(fā)生發(fā)展。 SS-31作為線粒體抗氧化劑，具有穩(wěn)定性好、水溶性好以及半衰期較長等優(yōu)點[11]，該藥物能在細胞膜上自由擴散，既往研究顯示SS-31很容易被細胞攝取[12-13]，如在神經母細胞瘤細胞中，30 min即可達到濃穩(wěn)態(tài)度。分離的鼠肝、腦線粒體的研究表明，SS-31能被線粒很快攝取，不到2 min就能達到最大吸收率[12]；深入的研究表明，85%被攝入線粒體的SS-31主要結合在線粒體內膜上[14]。為了更好地觀察SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性早期的保護作用，參考其他人的研究[15-16]，本研究采用預給藥的方式，讓細胞和線粒體充分攝取SS-31從而更好發(fā)揮作用。但研究也顯示SS-31的攝取不依賴于線粒體膜電位，去極化的線粒體也能攝取SS-31，提示發(fā)揮功能異常的線粒體也能攝取SS-31，已有研究應用SS-31于疾病發(fā)生之后觀察其療效[15, 17]。因此，本研究也觀察了SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性晚期的治療作用。以往研究發(fā)現(xiàn)可減少膿毒癥小鼠海馬神經元凋亡與炎癥反應，從而減輕腦損傷[18]；李國民等[19]研究發(fā)現(xiàn)SS-31可以改善膿毒癥誘導的急性肺損傷時的肺功能；王月華等[20]發(fā)現(xiàn)SS-31能夠抑制高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞凋亡。但SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性是否具有保護作用尚不明確。本研究結果顯示：SS-31可降低膿毒癥大鼠的肺、腎和腸血管通透性；同時在細胞水平上，SS-31可增加肺靜脈內皮細胞間的連接和TER。提示SS-31對膿毒癥大鼠的血管通透性有保護作用。那么，SS-31是通過什么分子機制發(fā)揮對膿毒癥大鼠的保護作用呢？ 目前關于SS-31研究較多的是作為一種抗氧化肽，作用在線粒體內膜上，通過抗氧化應激發(fā)揮其保護作用。如LI等[21]研究發(fā)現(xiàn)SS-31可通過抗氧化應激發(fā)揮對高糖誘導的糖尿病腎病的保護作用；LI等[22]研究發(fā)現(xiàn)SS-31對膿毒癥引起的器官功能障礙有保護作用，其機制與抑制促炎細胞因子、氧化應激有關。為此本研究也驗證了SS-31是否通過抑制線粒體氧化應激而發(fā)揮對膿毒癥血管通透性的保護作用。結果顯示膿毒癥后活性氧含量明顯增多，SS-31明顯降低細胞內的活性氧含量，結果提示SS-31對膿毒癥大鼠血管通透性的保護作用與抑制氧化應激有關。 綜上所述，本研究顯示SS-31對膿毒癥大鼠的血管通透性有保護作用，其機制與抑制氧化應激有關，為臨床膿毒癥的治療提供新的策略。 免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者所有，如有侵權，可刪除。 |
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