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合肥肽庫(kù)生物新蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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抗菌肽的設(shè)計(jì)與優(yōu)化研究進(jìn)展
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抗生素的出現(xiàn)為治療細(xì)菌感染提供了有力保障，然而由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問(wèn)題逐漸加劇。由于抗生素的研發(fā)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥的速度，導(dǎo)致人類健康面臨重大威脅，正在逐漸走向后抗生素時(shí)代[1]。相較于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有廣譜抗菌活性和低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，由于主要作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，不易產(chǎn)生耐藥性[2]，因此抗菌肽逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)成為新型抗菌藥。 抗菌肽是多細(xì)胞生物免疫防御的重要組成部分，在動(dòng)物、植物、微生物等生物體內(nèi)廣泛存在，可以從天然來(lái)源中提取或者通過(guò)化學(xué)方法合成[3]�？咕牡姆诸惙椒ㄓ泻芏�，基于生物合成機(jī)制，抗菌肽可分為核糖體抗菌肽和非核糖體抗菌肽[4]；根據(jù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)分類，可分為具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的肽、具有β-折疊結(jié)構(gòu)的肽、同時(shí)具有α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的肽以及富含某種氨基酸的線性肽等。此外，一些綜述將環(huán)狀或其他復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的肽歸為具有第五類結(jié)構(gòu)的抗菌肽[4]。非核糖體合成的抗菌肽通常只來(lái)自于細(xì)菌和真菌，其抗菌譜一般較窄，如多粘菌素B只對(duì)革蘭氏陰性菌有效[5]。而核糖體合成抗菌肽則來(lái)源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣，是抗菌肽領(lǐng)域研究的重要方向。本綜述主要針對(duì)核糖體合成的抗菌肽而展開(kāi)，這類抗菌肽是基因編碼的由陽(yáng)離子和疏水氨基酸組成的成熟肽，通常具有廣譜抗菌活性，長(zhǎng)度從2～50個(gè)氨基酸殘基不等，存在一定的空間結(jié)構(gòu)。 目前抗菌肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用仍然存在很多限制，如生物體內(nèi)的抗菌肽提取困難，生產(chǎn)成本高；部分抗菌肽具有全身毒性、體內(nèi)不穩(wěn)定性、抗菌活性低等問(wèn)題[6-7]。因此，研究者們以天然抗菌肽為模板，進(jìn)行衍生肽設(shè)計(jì)優(yōu)化，以期開(kāi)發(fā)出新的強(qiáng)效低毒抗菌肽藥物。本文將一些抗菌肽的設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法進(jìn)行總結(jié)分析，以期對(duì)抗菌肽藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的參考。 1 抗菌肽的設(shè)計(jì)與優(yōu)化 從廣義上講，設(shè)計(jì)與改造抗菌肽的方法大致可以分為三種：傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾(包括：引入天然氨基酸或非天然氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變、脂化修飾、糖基化修飾、雜交、環(huán)化等)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和高通量篩選。 1.1 傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾策略 基于天然多肽的一些缺陷，如細(xì)胞毒性和易被蛋白酶水解的不穩(wěn)定性等，直接使用天然多肽仍然受到很多限制，針對(duì)其進(jìn)行傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾，仍是克服此類弊端的常用策略。本文總結(jié)了一些傳統(tǒng)化學(xué)修飾的方法，包括引入天然或非天然氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變、模擬天然肽翻譯后修飾的化學(xué)修飾(糖基化修飾、氮端的脂化修飾等)、構(gòu)建雜交肽、環(huán)化等多種手段。 1.1.1 點(diǎn)突變 自然界中，20種基本天然氨基酸為：丙氨酸（alanine，A）、精氨酸（arginine，R）、天冬酰胺（asparagine，N）、天冬氨酸（aspartic acid，D）、半胱氨酸（cysteine，C）、谷氨酰胺（glutamine，Q）、谷氨酸（glutamic acid，E）、甘氨酸（glycine，G）、組氨酸（histidine，H）、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、賴氨酸（lysine，K）、甲硫氨酸（methionine，M）、苯丙氨酸(phenylalanine，F(xiàn))、脯氨酸（proline，P）、絲氨酸（serine，S）、蘇氨酸（threonine，T）、色氨酸（tryptophan，W）、絡(luò)氨酸（tyrosine，Y）、纈氨酸(valine，V)。 目前，采用天然或非天然氨基酸替換肽序列，進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)改造是多肽優(yōu)化設(shè)計(jì)中最常用的方法。凈電荷、疏水性、兩親性是影響抗菌肽抗菌活性的重要因素，改變抗菌肽的凈電荷是優(yōu)化其抗菌活性的一種有效策略。為了探究?jī)綦姾蓪?duì)肽活性的影響，Ramezanzadeh等[8]通過(guò)用帶正電荷的賴氨酸取代帶負(fù)電荷的氨基酸殘基的方式設(shè)計(jì)了天然肽Aurein 1.2（氨基酸序列：GLFDIIKKIAESF）的一系列衍生肽。與母肽相比，凈正電荷為+5的衍生肽Aurein M3（氨基酸序列：GLFKIIKKIWKSF）對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增強(qiáng)了8～64倍，對(duì)革蘭氏陰性菌的治療指數(shù)顯著增強(qiáng)，超過(guò)天然肽33倍以上，因此增加正電荷或可作為一種有效提高抗菌肽抗菌效力和選擇性的方法。 Schifano等[9]通過(guò)用疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或纈氨酸）均勻替換天然疏水殘基來(lái)修改肽序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疏水性降低，抗菌活性隨之降低或完全喪失。此外，Chen等[10]把肽V13KL（序列為：Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS- NH2）作為模板，通過(guò)用疏水的亮氨酸殘基取代丙氨酸殘基以增加肽疏水性，并通過(guò)反向操作以降低肽疏水性來(lái)對(duì)比闡述疏水性與抗菌活性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疏水性對(duì)于肽抗菌活性的影響存在一個(gè)閾值，一旦疏水性偏離最佳疏水閾值會(huì)導(dǎo)致抗菌效力降低，因此合理調(diào)整抗菌肽的疏水性可能獲得最佳抗菌活性。 抗菌肽的兩親性對(duì)于抗菌活性及抗菌譜選擇性也有很大影響，Zhu等[11]通過(guò)將RI16（序列為：RFRRLRKKTRKRLKKI-NH2）疏水面中心的蘇氨酸替換為色氨酸以增強(qiáng)兩親性，得到了T9W（序列為：RFRRLRKKWRKRLKKI-NH2）。相比較于母肽，T9W對(duì)銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）的抗菌活性顯著增加，MIC值降為原來(lái)的1/64�？偠灾�，正電荷、兩親性以及疏水性是影響抗菌肽抗菌作用的重要因素，合理運(yùn)用這些參數(shù)對(duì)多肽進(jìn)行改造是優(yōu)化抗菌肽的有效策略之一。 1.1.2 抗菌肽的翻譯后修飾 隨著對(duì)天然抗菌肽活性功能的深入研究，相同抗菌肽前體可以通過(guò)不同翻譯后修飾而獲得不同功能。這一研究為抗菌肽的設(shè)計(jì)改造提供了新的思路，可以在原有序列的基礎(chǔ)上增加不同的修飾對(duì)抗菌肽的活性功能進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。其中，脂化修飾和糖基化修飾對(duì)于優(yōu)化多肽活性顯示出更明顯的優(yōu)勢(shì)。如Li等[12]的文章中就報(bào)道了脂化修飾和糖基化修飾均可以增加多肽的穩(wěn)定性、膜滲透性和抗菌活性。親水肽和疏水脂肪酸通過(guò)酰胺鍵連接而成的脂肽，可以將部分脂尾插入細(xì)菌膜中，從而促進(jìn)該脂肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，增強(qiáng)疏水性和膜裂解能力，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性。但多肽的糖基化修飾是將糖苷基共價(jià)連接到肽鏈的特定殘基上，包括N-糖基化[13]、O-糖基化[14]、C-糖基化[15]和S-糖基化[16]。這種修飾方法更具有靶向性，有助于提高其對(duì)于目標(biāo)細(xì)菌的結(jié)合能力從而增強(qiáng)抗菌活性。例如，Kamysz等[17]通過(guò)脂化修飾的方法，將肽KR12（序列為：KRIVQRIKDFLR-NH2）的N-末端與一系列N-烷基脂肪酸和芳香酸綴合，在增加抗菌活性的同時(shí)增強(qiáng)了其抗生物膜的活性。而Su等[16]通過(guò)S-糖基化修飾的方法，將抗菌肽ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，EPL)與殼聚糖(chitosan，CS)共價(jià)結(jié)合，顯著增強(qiáng)其對(duì)陰離子微生物膜的破壞能力，同時(shí)不會(huì)破壞哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜。 1.1.3 雜交肽 多條肽鏈或肽鏈片段之間雜交可以得到一條新的多肽，研究人員通過(guò)這種方法獲取新興肽段以期達(dá)到增強(qiáng)抗菌效力并降低細(xì)胞毒性的目的。這種新興肽段通常被稱為“雜交”肽[18]。例如，將靶向肽和抗菌能力較強(qiáng)的肽雜交是一種常見(jiàn)的設(shè)計(jì)策略，即利用靶向肽來(lái)提高廣譜抗菌肽的特異性，從而達(dá)到選擇性地消除病原體的目的。其中，一種特異性抗糞腸球菌（enterococcus faecalis， E. faecalis）的美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection， ATCC）29212菌株的合成抗菌肽[19]，是將E. faecalis特異性信息素cCF10（序列為：LVTLVFV）與肽C6（WKWKWKNGKWKWKW）融合得到cCF10-C6，再通過(guò)用E取代陽(yáng)離子K殘基來(lái)修飾該肽的凈電荷從而進(jìn)一步提高特異性。 此外，雜交策略也可以增加多肽對(duì)微生物的選擇性。例如，Choudhury等[20]將從噬菌體文庫(kù)篩選得到的靶向葡萄球菌的抗菌肽A12C（序列為：VHMVAGPGREPT）分別與廣譜抗菌肽假黑盤(pán)菌素（plectasin）（序列為：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGG FVCKCY）和神經(jīng)肽（eurosin）（序列為：GFGCPGDAYQCSEHCRALGGGRTGGYCAGPWYL GHPTCTCSF）融合。MIC實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)的plectasin或eurosin相比，融合肽保留了plectasin和eurosin抑制金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S. aureus）ATCC 35556菌株的能力，對(duì)其他菌株，如E. faecalis ATCC 47077菌株、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis, B. subtiliss） ATCC 6051菌株和鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus， L. rhamnosus）ATCC 7469菌株的抗菌能力顯著降低。此外，Kim等[21]的課題組報(bào)道了靶向肽PA2（序列為：SQRKLAAKLTSK）和高效抗菌肽GNU7（序列為：RLLRPLLQLLKQKLR）組合而成的雜交肽PA2-GNU7（MIC = 2 μmol），可以特異性靶向P. aeruginosa；并且在多重耐藥P. aeruginosa感染小鼠模型中，PA2-GNU7（濃度為：25 mg/kg）治療組與美羅培南（meropenem）治療組相比，PA2-GNU7的治療存活率增加了75%以上，顯著高于meropenem。 1.1.4 環(huán)狀肽 抗菌肽的空間構(gòu)象是影響抗菌作用的重要因素之一。雖然抗菌肽具有一定的空間構(gòu)象(α-螺旋和β-折疊)，但相較于蛋白質(zhì)，由于抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)較短，空間構(gòu)象易隨環(huán)境發(fā)生改變進(jìn)而影響抗菌作用，因此有效固定空間構(gòu)象可以作為保持抗菌活性的重要策略之一。肽環(huán)化是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定空間構(gòu)象的一種有效手段。此外，環(huán)化肽可以增加多肽類藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性。研究表明，由于環(huán)化肽具有蛋白酶水解穩(wěn)定性和構(gòu)象剛性，所以表現(xiàn)出良好的抗菌活性和較強(qiáng)的細(xì)胞選擇性，而且也能降低宿主細(xì)胞毒性[22]。多肽類藥物一般呈現(xiàn)四種常見(jiàn)的環(huán)化類型，包括：頭-尾環(huán)化、頭-側(cè)鏈環(huán)化、側(cè)鏈-尾環(huán)化、側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化[23]，如圖1所示，其中R基代表氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)不同。頭-尾環(huán)化通常采用直接耦合的方法來(lái)環(huán)化線性肽前體，在肽的C-端羧酸和N-端氨基之間形成酰胺鍵，由于缺乏極性的N-端或C-端，使得到的環(huán)化肽更耐外肽酶的水解，但會(huì)受到環(huán)的大小和肽序列的限制，且容易發(fā)生C端異構(gòu)化、環(huán)二聚化和偶聯(lián)效率低等問(wèn)題[24]。頭-側(cè)鏈或側(cè)鏈-尾環(huán)化，則是C-端羧酸或者N-端氨基與側(cè)鏈氨基酸殘基中的官能團(tuán)之間形成內(nèi)酰胺、內(nèi)酯或硫內(nèi)酯[24]，從而表現(xiàn)出更高的細(xì)胞通透性和對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。 圖片 側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化是目前穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用的策略，不同的側(cè)鏈官能團(tuán)會(huì)在兩個(gè)氨基酸殘基之間形成不同的“橋”。比如，防御素是一類由分子內(nèi)二硫鍵橋連而成的天然抗菌肽，受防御素的啟發(fā)，Mwangi等[25]通過(guò)在靠近N-和C-末端的地方引入兩個(gè)半胱氨酸殘基，將線性的抗菌肽cathelicidin-BF15-a3（序列為：VKRWKKWKRKWKKWV-NH2）轉(zhuǎn)化為環(huán)肽ZY4（序列為：VCKRWKKWKRKWKKWCV-NH2）。該環(huán)肽對(duì)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection， CICC）21625的P. aeruginosa菌株和鮑曼不動(dòng)桿菌（acinetobacter baumannii， A. baumannii） ATCC 22933菌株具有良好的抗菌活性，且血清穩(wěn)定性較高。此外，通過(guò)共價(jià)鍵合同一螺旋面（如i和i + 4、i和i + 7位置）上的兩個(gè)氨基酸使肽鏈環(huán)化得到的釘合肽，常被用來(lái)穩(wěn)定α-螺旋構(gòu)象，從而保持其與靶標(biāo)的結(jié)合能力。目前已經(jīng)有各種高選擇性的化學(xué)連接方法被開(kāi)發(fā)用于合成釘合肽，如閉環(huán)復(fù)分解（ring-closing metathesis， RCM）、炔烴和疊氮之間的點(diǎn)擊化學(xué)、二硫鍵和硫醚等[22]。在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)（data repository of antimicrobial peptides，DRAMP）3.0中（網(wǎng)址為：https://dramp.cpu-bioinfor.org/），也特別新增并強(qiáng)調(diào)了釘合肽[26]。最近Li等[27]開(kāi)發(fā)了一種合成釘合肽的新方法，通過(guò)N-烷基化反應(yīng)將兩個(gè)賴氨酸殘基連接在陽(yáng)離子α-螺旋抗菌肽的親水表面上，從而形成賴氨酸釘合環(huán)肽。他們以抗菌肽OH-CM6（序列為：KFFKKLKKAVKKGFKKFAKV）為模板合成一系列新型環(huán)肽，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種方法在保留凈電荷和不會(huì)誘導(dǎo)溶血的同時(shí)，提高了抗菌活性和蛋白酶穩(wěn)定性。 1.2 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)策略 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)是一種利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)抗菌肽的方法。經(jīng)典方法常通過(guò)以生物分子互作為基礎(chǔ)，例如依據(jù)已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)同源建模，篩選活性多肽結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)抗菌肽，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)中自由能計(jì)算篩選潛在活性抗菌肽。此外，還包括集成多組學(xué)研究，例如通過(guò)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)模型、深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等的方式，聯(lián)合多組學(xué)分析與疾病分子的作用機(jī)制，從而深入開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)優(yōu)化抗菌肽。另外，應(yīng)用抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析，也可以作為獲得有效抗菌肽的方法之一[28]。為了探究抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系，可以采用不同機(jī)器學(xué)習(xí)方法，包括：支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）[29]、隨機(jī)森林(random forest，RF)[30]和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等方法。此外，在大量可用數(shù)據(jù)集的背景下，定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure–activity relationship，QSAR）模型可以將一組肽的序列特征（預(yù)測(cè)變量）與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（響應(yīng)變量）的抗菌活性值的相關(guān)性聯(lián)系起來(lái)。Waghu等[31]建立了抗菌肽家族cathelicidins的QSAR模型，并應(yīng)用該模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)對(duì)大腸桿菌（escherichia coli，E. coli）ATCC 25922菌株有活性的新肽。C肽（C-peptide，CP）（序列為：GGLRRLGRKILRAVKKYG），是一種基于該家族QSAR模型設(shè)計(jì)的肽，具有很高的抗菌活性，且預(yù)測(cè)活性與體外測(cè)試抗菌活性的MIC均為6.25～12.5 μmol。因此，已有的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)可以作為識(shí)別和優(yōu)化抗菌肽的有效工具。 遺傳算法從潛在序列中優(yōu)化特定屬性（適應(yīng)度函數(shù)）[32]，借此可以尋找具有最佳抗菌活性的肽。Porto等[33]將從番石榴（psidium guava）中分離出的抗菌肽Pg-AMP1作為模板，通過(guò)遺傳算法設(shè)計(jì)得到一個(gè)抗菌肽庫(kù)，然后篩選該庫(kù)中多肽對(duì)P. aeruginosa ATCC 27853菌株的活性，并選取疏水力矩和α-螺旋參數(shù)結(jié)合抗菌活性進(jìn)行矩陣回歸指導(dǎo)設(shè)計(jì)優(yōu)化。其中，抗菌肽Guavanin2（序列為：RQYMRQIEQALRYGYRISRR）是利用該方法設(shè)計(jì)優(yōu)化的最優(yōu)抗菌肽(MIC = 25 μmol），體外篩選最優(yōu)且對(duì)革蘭氏陰性菌具有選擇性。 化學(xué)空間是由所有可能的有機(jī)小分子組成的屬性空間，包括存在于生物系統(tǒng)中的抗菌肽。使用各種算法去探索肽化學(xué)空間的特定區(qū)域，并生成有針對(duì)性的肽虛擬庫(kù)，然后通過(guò)虛擬篩選化學(xué)空間確定設(shè)計(jì)合成和經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的過(guò)程，能更準(zhǔn)確地識(shí)別新的有效抗菌肽[34]。Di等[35]利用化學(xué)空間的概念，并分析肽活性相關(guān)的分子形狀和藥效團(tuán)來(lái)設(shè)計(jì)生成抗菌雙環(huán)肽（antimicrobial bicyclic peptide，AMBP）虛擬庫(kù)。他們通過(guò)插入線性序列的兩個(gè)半胱氨酸殘基與N端的3,5-雙（氯甲基）甲苯基［3,5-bis（chloromethyl）toluoyl，B］之間形成雙分子硫醚，從而提供了雙環(huán)結(jié)構(gòu)。其中，D-型雙環(huán)肽bp56（序列為：B12LKKKLKC1LC2KLLKKLL， 1和2表示環(huán)化點(diǎn)， L為D-型亮氨酸， K為D-型賴氨酸， C為D-型半胱氨酸）能有效地殺死實(shí)驗(yàn)室保存的P. aeruginosa PAO1菌株（MIC = 4 μg/mL）及其他多藥耐藥的P. aeruginosa菌株（ATCC編號(hào)為：PEJ2.6、16051788、16050914、16060789、X1604603，MIC均為8 μg/mL）。 無(wú)論是以合成還是抗菌活性篩選的方式制備優(yōu)化抗菌肽，成本都較為昂貴且耗時(shí)較長(zhǎng)，因此如果能利用生物信息學(xué)資源和使用計(jì)算機(jī)輔助分析抗菌肽數(shù)據(jù)從而優(yōu)化抗菌肽抗菌功能就不失為一種有效途徑。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法使人們能夠借助多種算法去探索抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系�？咕膸�(kù)也可以提供數(shù)據(jù)或者模板序列，從而促進(jìn)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和優(yōu)化創(chuàng)新肽序列。 1.3 高通量篩選 高通量篩選是一種基于通量和覆蓋范圍的篩選方法。傳統(tǒng)高通量篩選有效抗菌肽的方式，主要采用噬菌體展示。噬菌體展示能夠得到多樣性的肽庫(kù)，為設(shè)計(jì)有效抗菌肽提供了新思路。Heinis等[36]通過(guò)噬菌體展示法得到雙環(huán)肽，首先在絲狀噬菌體表面生成了序列為C-X6-C-X6-C的線性肽庫(kù)，其中C是半胱氨酸，X是20種天然氨基酸中的任意一種；然后再通過(guò)將線性肽與小分子支架三(溴甲基)苯［tris-（bromomethyl）benzene，TBMB］反應(yīng)，TBMB選擇性地烷基化序列中的三個(gè)C殘基，將線性肽轉(zhuǎn)化為雙環(huán)肽。 此外，點(diǎn)合成（spot synthesis）也是高通量篩選方法，主要在纖維素上合成肽陣列，可以直接篩選合成數(shù)百個(gè)肽，提供了在平面上直接合成大量肽的可能性[37]。Hilpert等[38]利用點(diǎn)合成篩選了一個(gè)基于牛抗菌肽bactenecin衍生物（序列為：RLARIVVIRVAR-NH2）組成的完整替代文庫(kù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的Sub3（序列為：RRWRIVVIRVRR-NH2）顯示出廣譜活性，對(duì)E. coli UB1005菌株的MIC低至0.5 μg/mL。 1.4 其他設(shè)計(jì)方法 1.4.1 短片段重復(fù)設(shè)計(jì)肽 幾個(gè)氨基酸進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)也可被設(shè)計(jì)合成為有效抗菌肽[39-41]。如Wang等[42]構(gòu)建了（XYPX）n重復(fù)單元，其中X代表異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，Y代表精氨酸或賴氨酸，P代表脯氨酸。然后對(duì)氨基酸進(jìn)行排列組合并進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)具有七個(gè)重復(fù)單元的肽R7I（序列為：IRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPI-NH2），對(duì)革蘭氏陰性菌具有較好的抗菌活性，同時(shí)在小鼠腹膜炎模型中仍保持優(yōu)異的活性。 色氨酸拉鏈（trpzip）肽是已知最穩(wěn)定的β-發(fā)夾肽之一，無(wú)需共價(jià)二硫化物約束或金屬結(jié)合即可自發(fā)折疊，其β-片層臂可由簡(jiǎn)單的氨基酸組成。Xu等[43]以（WK）nPG（KW）n-NH2（n = 1、2、3、4、5， P代表D-型脯氨酸）為模板，設(shè)計(jì)得到五條抗菌肽。MIC結(jié)果表明，WK3（序列為：WKWKWKPGKWKWKW-NH2）和WK4（序列為：WKWKWKWKPGKWKWKWKW-NH2）的抗菌效力最強(qiáng)，六種測(cè)試菌株的MIC均為1～4 μmol，但WK3具有更好的選擇性。這表明，肽的抗菌效力隨著重復(fù)單元的增加而增加，進(jìn)一步增加鏈長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致抗菌活性降低甚至喪失。 1.4.2 自組裝抗菌肽 利用多肽單元之間通過(guò)如氫鍵、π-π堆積等非共價(jià)相互作用自發(fā)形成有序的納米球或納米管等超分子結(jié)構(gòu)，通常需要多條肽鏈的合作才能在細(xì)菌膜上打孔[44]。Shen等[45]設(shè)計(jì)了一種在陰離子溶液（pH > 9.4）中自組裝成納米纖維的陽(yáng)離子八肽，即FF8（序列為：KRRFFRRK）。該肽特異性靶向帶負(fù)電的類脂膜，在脂膜表面累積并在其上自組裝成納米纖維，是革蘭氏陰性菌的有效抗菌肽和選擇性試劑（如對(duì)E. coli和S. aureus的MIC分別為25.6 μmol和625 μmol）。 2 不同設(shè)計(jì)與優(yōu)化方法的對(duì)比 本文描述了幾種不同抗菌肽的設(shè)計(jì)與優(yōu)化策略，通過(guò)對(duì)不同方法進(jìn)行比較，可以提高優(yōu)化效率。 傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾策略是藥物發(fā)現(xiàn)從初步篩選到先導(dǎo)優(yōu)化的關(guān)鍵方法。點(diǎn)突變是對(duì)多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，雖然簡(jiǎn)單直接，但優(yōu)化過(guò)程工業(yè)化生產(chǎn)和人工篩選的成本通常比較高。N-末端脂化修飾可以提高抗菌肽的疏水性，增強(qiáng)膜滲透性，但未考慮降低抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性的問(wèn)題；糖基化修飾更傾向于改善抗菌肽的穩(wěn)定性和靶向識(shí)別結(jié)合目標(biāo)的能力，但缺乏創(chuàng)新性。構(gòu)建雜交肽可以增強(qiáng)多肽的靶向特異性和對(duì)微生物的選擇性，在提高靶向殺菌能力的同時(shí)可以保護(hù)有益菌群，但因其僅能殺滅一種細(xì)菌從而導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受到限制。環(huán)化是對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，雖然空間構(gòu)象穩(wěn)定、具有細(xì)胞選擇性并能降低細(xì)胞毒性，但環(huán)化過(guò)程易產(chǎn)生異構(gòu)體、二聚體，且環(huán)化效率低，可能需要對(duì)肽鏈基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜。 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)策略雖然更具有創(chuàng)新性，但肽庫(kù)篩選規(guī)模相對(duì)龐大且迭代和篩選成本較高，新的軟件算法的開(kāi)發(fā)也依然需要提升。高通量篩選具有直接靶向性，篩選規(guī)模介于傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾策略與計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)策略之間，篩選成本也相對(duì)較高。綜上，目前已有的多種設(shè)計(jì)優(yōu)化方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者們可依據(jù)客觀條件綜合考慮后擇優(yōu)選擇。 3 結(jié)論與展望 抗生素濫用引發(fā)的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題迫使人們必須加快新型抗菌藥物的研發(fā)步伐�？咕耐哂卸靖弊饔眯『筒灰渍T發(fā)耐藥性的特點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)成為新型抗菌候選藥物。然而天然抗菌肽通常存在體內(nèi)有效性低、毒性高且生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，因此對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)與優(yōu)化，增強(qiáng)其作為候選藥物的潛力。 目前設(shè)計(jì)與優(yōu)化抗菌肽的方法包括傳統(tǒng)化學(xué)改造和修飾策略、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等，同時(shí)高通量肽合成和篩選技術(shù)也加快了該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。無(wú)論是是簡(jiǎn)單的氨基酸替換，還是復(fù)雜的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，在設(shè)計(jì)和優(yōu)化抗菌肽以及提高肽抗菌活性方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。但是目前的研究仍然存在一些局限，比如大多數(shù)抗菌肽的研究只在幾種微生物菌種上進(jìn)行測(cè)試；研究者測(cè)試抗菌肽的MIC方法尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；不同研究報(bào)道的同種細(xì)菌不同菌株的MIC測(cè)試值不能直接進(jìn)行比較總結(jié)；新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)需要多學(xué)科環(huán)境，包括微生物學(xué)、藥物化學(xué)、合成化學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域等。盡管存在這些不足，但隨著設(shè)計(jì)方法的進(jìn)步，未來(lái)將會(huì)開(kāi)啟更多設(shè)計(jì)新型抗菌肽的可能性，從而得到更安全、更有效、更具有臨床應(yīng)用潛力的候選藥物。 免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除 |
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