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蛋白實(shí)驗(yàn) | 蛋白質(zhì)雙向電泳
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蛋白質(zhì)雙向電泳是將蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量兩種特性結(jié)合起來進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的技術(shù)。蛋白質(zhì)雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢? Isoelect rofocusing ,IEF) , 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離; 第二向?yàn)镾DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE ) , 按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過電荷和分子量兩次分離后, 可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。簡明地理解，第一項(xiàng)進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。 第一向（等電點(diǎn)聚焦，IEF） 一、凝膠條的準(zhǔn)備 以帽凝膠端（2個校準(zhǔn)環(huán)：4mm和10mm）朝下，將4根玻璃管插入兩個凝膠灌注裝置的每個托架中，這樣玻璃管恰好站在兩個分隔室之一的“充填船”上。從玻璃管頂端到玻璃管底端拉入PP線（小心，線不易移動），否則以后將不能用它們將膠溶液拉上來。 溶解分離膠溶液和過硫酸銨溶液。必須監(jiān)控凝膠溶液的溫度，因?yàn)楦邷叵拢ù笥?5℃）聚合作用太快。 分離膠溶液除氣4分鐘，在桌子邊緣輕彈玻璃管壁，避免產(chǎn)生氣泡。 融化帽凝膠溶液，除氣，步驟同3。 用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分離膠溶液中，溶液應(yīng)小心搖晃，避免氧氣進(jìn)入膠內(nèi)。 將分離膠溶液加到兩個凝膠灌注裝置的每一個充填船里（每4個管700μl）。所有的玻璃管末端都必須浸沒于凝膠溶液中。 小心將PP線抽出，將凝膠溶液拉上至23mm的標(biāo)記。 換充填船分隔室。 使用一個Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝膠溶液中，輕輕振蕩使之混勻。 在兩個凝膠灌注裝置的每個充填船中的空余分隔室內(nèi)加入200μl帽凝膠溶液；凝膠溶液應(yīng)到達(dá)17mm的標(biāo)記。 移去充填船，允許凝膠溶液到達(dá)13mm的標(biāo)記。經(jīng)過這一步，有空氣進(jìn)入管子底端和4mm標(biāo)記處。 聚合30分鐘后，將PP線抽出，去除凝膠表面未聚合的溶液。在毛細(xì)血管口部滴加一大滴去離子水，這樣在凝膠的上邊形成一個潮濕的室，在凝膠和水滴之間形成一個氣泡。用此方法形成一個潮濕的室，隨后用Parafilm膜封上帽凝膠一側(cè)。凝膠在室溫過夜，可以使之進(jìn)一步聚合。制備好的管子如果保存于室溫，可以在第二天使用，或最遲在制備好第五天使用。 二、加樣 將乙二胺加入陰極溶液，除氣5min，下槽裝陰極溶液。 融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl兩性電解混合液到100mg Sephadex膠中，在渦旋器上充分振蕩10～15分鐘。 從凝膠灌注裝置移走凝膠管，把它們插入聚焦槽的陽極部分，仍應(yīng)看到13mm標(biāo)記。帽凝膠一端朝上。 將陰極溶液加入管子的陰極一邊，不要有氣泡（事先已除去水）。 將聚焦槽的陽極部分安放到聚焦槽的底部，管子必須浸入陰極溶液。 除去水，并將加樣側(cè)干燥。使用一個伸長的巴斯德移液管或凝膠裝填移液管頭將水吸去，然后用濾紙條將凝膠表面干燥。 融解準(zhǔn)備好的樣品和覆蓋溶液。 用凝膠裝填移液管頭，迅速在膠上覆蓋大約2mm厚的Sephadex。 用一個凝膠裝填移液管頭，裝入樣品（1～15μl），加到Sephadex表面。加樣時(shí)，尖端必須接觸Sephdex表層，樣品應(yīng)小心加入，避免氣泡。 使用凝膠裝填頭，輕輕在樣品上加入5μl覆蓋液并分層，不要使覆蓋液和樣品相混合。然后在毛細(xì)血管中加入陽性溶液，不要引入氣泡。 所剩的陽極溶液加入上槽，用緩沖液覆蓋所有的管子。 三、IEF電泳 凝膠平衡 融解平衡溶液（在IEF結(jié)束前1小時(shí)）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。 IEF結(jié)束后，移去管子中的陽性和陰性溶液。 用87％的甘油溶液覆蓋帽（cap）凝膠一側(cè)。 加5ml平衡溶液到Petri盤。 用PP線擠出凝膠：PP線從帽凝膠一側(cè)插入，管子加樣一側(cè)浸入去離子水，小心地向下擠出凝膠。與此同時(shí)可看到水中的覆蓋液的溶解。凝膠被拉出5min后，用水迅速清洗擠壓端。然后將管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盤子上，整個凝膠被PP線拉到盤子里。每個盤子里可平衡兩塊膠。 室溫振蕩平衡凝膠10分鐘整。 IEF之后，如果凝膠并不立刻使用，應(yīng)倒出平衡緩沖液，并在Petri盤中－70℃保存。－20℃保存導(dǎo)致分辨率降低；液氮保存將破壞凝膠。 第二向（SDS－PAGE） 一、SDS-PAGE膠的制備 加熱瓊脂糖溶液至70℃使之液化。 冷卻瓊脂糖溶液至40℃，保持液態(tài)。 噴灑70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干凈。 融解凝膠溶液和APS。 將玻璃板夾入夾緊裝置，該夾緊裝置放在灌裝支架的前面狹槽中，這樣旋鈕對著支架，而“尖角”向上。充分旋轉(zhuǎn)旋鈕以使厚的有機(jī)玻璃正好對齊后部邊緣。這時(shí)大玻璃板可以放在有機(jī)玻璃板的前面，隔板沿著左邊和右邊的邊緣。插入小板，用拇指輕壓玻璃板和隔板以確使玻璃板位于底部。用鉗子夾緊做好的“三明治”，后部邊緣出現(xiàn)Newton環(huán)說明旋鈕已經(jīng)非常緊了。不要將旋鈕旋得過于緊，否則玻璃板會被夾碎。將三明治從支架抽出，用拇指檢查玻璃板和隔板是否與底部齊平。 在小玻璃板底部起172.5px處做標(biāo)記，做為加樣得輔助（凝膠長度為165px）。 將凝膠“三明治”裝置夾到灌裝支架上，旋鈕向內(nèi)，“尖角”向上。在有機(jī)玻璃板上加壓以使凝膠三明治插入小突起下面。 將18ml凝膠溶液和1.2ml APS相混合，不要有氣泡。溶液必須混勻，不要引進(jìn)氧氣。 含有凝膠溶液得容器放在加樣槽的后面玻璃板上，這樣凝膠溶液可以沿著加樣槽從玻璃板流下而沒有氣泡，分離膠被加到標(biāo)記處。 迅速用去離子水覆蓋凝膠溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝膠一端用一巴斯德移液管防止攪動凝膠溶液，并使水在凝膠表面均勻地分層。60分鐘后，凝膠可以用于SDS-PAGE電泳。 二、加樣 用濾紙條去除凝膠表面的去離子水。 將凝膠“三明治”放到電極裝置上（旋鈕沖外，尖角向上）：首先將凝膠“三明治”放到電極裝置的上面部分，向電極裝置擠壓它使下面一部分固定。 在平板凝膠表面加IEF凝膠：從平衡緩沖液中取出凝膠條，縱向放到厚有機(jī)玻璃板的邊緣，盡量使凝膠條與加樣槽的邊緣靠近。使用小刮勺，將凝膠條輕輕向下推，使之小心的滑入加樣槽。凝膠條必須位于SDS-PAGE的表面，沒有氣泡。 使用Pasteur移液管，將加樣槽加滿40℃的瓊脂糖溶液（沒有氣泡），2分鐘后，瓊脂糖溶液應(yīng)凝固。 在電極裝置裝入凝膠“三明治”以后，將BioRad槽注入620ml電極溶液，加溶液的時(shí)候避免泡沫和氣泡的形成。內(nèi)槽中電極緩沖液面應(yīng)到達(dá)電極裝置中紅塑料點(diǎn)的位置。 三、SDS－PAGE電泳 在將槽封閉之前，需要確定有機(jī)玻璃表面是否干燥，以避免形成“漸進(jìn)”電流，凝膠表面必須覆蓋電極緩沖液。 電壓必須如下表所示分段升高，電流和功率要調(diào)到電源的最大值。電流值如表所述并在每一部內(nèi)逐漸減小。 SDS-PAGE結(jié)束之后，倒出電極緩沖液，從電極裝置中取出凝膠“三明治”。輕微地彎曲隔板，將小玻璃板拉開以取出凝膠。凝膠可以轉(zhuǎn)移到固定溶液中。 固定之后，可以采用幾種染色方法。 注意事項(xiàng) 樣品預(yù)處理是雙向電泳的關(guān)鍵。等電聚焦電泳的樣品中必須去除鹽離子、色素、酚類和核酸等物質(zhì), 還要加入防止蛋白質(zhì)水解的抑制劑, 所以根據(jù)不同樣品需要查閱有關(guān)資料進(jìn)行樣品預(yù)處理。聚焦的好壞與兩性電解質(zhì)的質(zhì)量也有關(guān)系。 |
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