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百事可愛66新蟲 (小有名氣)
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動(dòng)物造模 | 深靜脈血栓動(dòng)物模型的構(gòu)建
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靜脈血栓（Deep vein thrombosis，DVT）是多種因素引起的靜脈血栓性疾病，是目前臨床常見疾病并發(fā)癥之一。該病發(fā)病率高，危害性大。靜脈血栓成因復(fù)雜，主要有遺傳因素、創(chuàng)傷、血液粘度增大、長期固定、血管內(nèi)皮功能異常等。目前血栓的發(fā)生發(fā)展的具體信號(hào)傳導(dǎo)通路還不完全明確，研究血栓形成的信號(hào)傳導(dǎo)通路、標(biāo)志性的早期預(yù)警因子及預(yù)防、治療的藥物的研發(fā)都離不開動(dòng)物模型。所以如何高效合理建立靜脈血栓動(dòng)物模型有助于深入探索深靜脈血栓形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的病理過程和分子機(jī)制，并有助于研究早期預(yù)警、治療方法和藥物選擇。 目前制備深靜脈血栓動(dòng)物模型的方法很多，主要是依據(jù)血流淤積、靜脈內(nèi)皮損傷和血液高凝狀態(tài)進(jìn)行制備DVT動(dòng)物模型。具體選用何種動(dòng)物及制備方法需根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求和條件選擇。 動(dòng)物的選擇 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與實(shí)驗(yàn)結(jié)果息息相關(guān)，一般主要選擇與人類基因較為密切的活體動(dòng)物，但隨著對DVT研究的目的、條件不同，對動(dòng)物的選擇也有差異，這些差異還包括人與動(dòng)物體型大小、壽命、血管大小和規(guī)格等差異。DVT研究對模型動(dòng)物的要求主要體現(xiàn)在四方面：一要考慮DVT發(fā)展過程（急性、慢性、亞急性）的不同在動(dòng)物身上的體現(xiàn)；二要確保動(dòng)物模型形成的血栓穩(wěn)定可靠，且與人體靜脈血栓形成的病理過程一致；三要保證造模動(dòng)物成活率高，存活時(shí)間長；四要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否易管理、易飼養(yǎng)、費(fèi)用高低等問題。選擇時(shí)應(yīng)綜合評(píng)判，目前常用于DVT造模的動(dòng)物如下： 小鼠 小鼠繁殖能力強(qiáng)且周期快，是生命科學(xué)研究中最常用來造模的動(dòng)物。小鼠常用于DVT的研究，其優(yōu)勢在于易獲取、價(jià)格低、飼養(yǎng)方便、適應(yīng)能力強(qiáng)、造模時(shí)間短，代謝率高。有研究者認(rèn)為鼠模型，尤其是涉及腎靜脈平面以下的下腔靜脈模型，技術(shù)操作簡單，實(shí)驗(yàn)成功率也高，且廣泛應(yīng)用于急性和慢性DVT的研究。但小鼠模型也有其局限性：小鼠體積小，下腔靜脈較細(xì)，且沒有瓣膜，多用血管結(jié)扎手法造模，形成的血栓采集困難，且血流動(dòng)力學(xué)、血管大小、凝血及演變過程與人類DVT形成及演變必然存在一定的差異。 其他鼠類 包括大鼠和裸鼠等。大鼠也常用于DVT模型的研究，其較小鼠的適應(yīng)能力、生存能力及抗感染能力更強(qiáng)，相比于其它中大型動(dòng)物而言價(jià)格低，血栓完全形成的時(shí)間快，但大鼠與小鼠存在同樣的局限性。裸鼠也可用于DVT造模，裸鼠先天缺乏T細(xì)胞免疫，不干預(yù)異體組織和細(xì)胞，可以使用人類自身的細(xì)胞觀察血栓溶解、機(jī)化的過程，這是其他動(dòng)物模型所不具備的，但裸鼠生存對環(huán)境要求嚴(yán)格，故臨床DVT造模時(shí)較少選用。 兔 兔子性格溫順，與大鼠對比，兔下腔靜脈較粗大，造模操作更容易，且血栓長度長，易于采集，血量更豐富，兩者都可形成穩(wěn)定的血栓，成功率高，也符合人體DVT急性期病理演變的特點(diǎn)，除價(jià)格較鼠類貴外無明顯差異；相比犬、豬等大型動(dòng)物，購買成本及飼養(yǎng)成本低，給藥方便，利于實(shí)驗(yàn)觀察。但兔子對感染的耐受力差，且由于生存周期長，老齡兔搜集困難。 其他動(dòng)物 豬、犬和狒狒這類非人類的靈長類動(dòng)物也可用于DVT造模，這類大型動(dòng)物有與人類相似的靜脈解剖結(jié)構(gòu)，在血流動(dòng)力學(xué)和血液學(xué)參數(shù)上具有其他動(dòng)物不可比擬的優(yōu)勢，且靜脈粗、條件好、便于觀察，從而補(bǔ)充其他動(dòng)物模型相關(guān)的不足，缺點(diǎn)則在于靜脈壁較薄、對操作者技術(shù)要求高、管理困難，死亡率高，且飼養(yǎng)條件和經(jīng)濟(jì)成本等也較其他動(dòng)物高，此外，并不是所有的大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型都具有與人類的相似性和關(guān)聯(lián)性。 造模方法 下腔靜脈結(jié)扎法 下腔靜脈結(jié)扎法原理為：通過手術(shù)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下腔靜脈阻塞造成： （1）局部血管損傷，暴露血管內(nèi)皮下組織因子； （2）局部造成低氧環(huán)境和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞變性，細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡形成，細(xì)胞水腫呈球形等因素； （3）損傷后炎癥細(xì)胞浸潤及各種細(xì)胞因子釋放。 操作方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，沿腹白線切開進(jìn)入腹腔，將小腸用一塊濕紗布包裹保護(hù)后推置于動(dòng)物右側(cè)腹腔，顯露下腔靜脈及其主要屬支，于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，后還納腸管并關(guān)閉腹腔。 評(píng)價(jià)：此法在研究溶栓和觀察血栓的動(dòng)態(tài)過程中并不適用，且與人體DVT疾病的形成和演變不相符。 下腔靜脈狹窄法 通過外力加壓下腔靜脈致血流減少，導(dǎo)致層狀血栓形成，在保證血栓形成穩(wěn)定性的同時(shí)，保持近心端通暢。 操作方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，取腹部正中切口并將小腸牽至腹外，不結(jié)扎周圍分支。用外科神經(jīng)血管鉗在15 s內(nèi)鉗夾腎靜脈以下的下腔靜脈2次，再用1根5-0縫線縱向置于下腔靜脈腹面，另1根4-0絲線繞在下腔靜脈和縫線周圍，之后移除縫線，讓血液流過。另外一種改進(jìn)法是：沒有外力加壓，但結(jié)扎側(cè)分支，保持后側(cè)分支開放，將 1 根 30 號(hào)的針頭與下腔靜脈用 7-0縫線一并綁繞，再移除針頭造成血管大約90%的狹窄。 評(píng)價(jià)：該方法成栓原因?yàn)檠芸s窄和內(nèi)皮損傷，且移除針管后血管部分再通，所以，該方法被認(rèn)為適用于研究深靜脈血栓啟動(dòng)機(jī)制研究和動(dòng)態(tài)分析溶栓藥物機(jī)制。 電解下腔靜脈法 電解法的原理是直流電作用于血管，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。 操作方法：首先麻醉動(dòng)物并顯露下腔靜脈及其屬支，結(jié)扎下腔靜脈周圍部分屬支。分別用1個(gè)針頭，連接到1個(gè)鍍銀的銅線并插入皮下組織（陰極）和尾部的下腔靜脈（陽極），施加 250 μA 的直流電 15 min，引起內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)形成血栓錨，并認(rèn)為造模 2 d 后是急性 DVT，14 d 后是慢性 DVT。 評(píng)價(jià)：此法建模過程中血管溫度穩(wěn)定，血流影響小，類似于臨床上的深靜脈血栓形成條件，對局部組織刺激較小，適合研究血栓形成位置局部的細(xì)胞因子等變化。 促凝物質(zhì)干預(yù)法 促凝物質(zhì)干預(yù)法就是通過增加局部血液中促凝因子，促進(jìn)血栓形成。 操作方法有：局部注射促凝劑或糖皮質(zhì)激素等藥物，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液高凝狀態(tài)而產(chǎn)生 DVT。此法能夠減輕手術(shù)刺激模擬非手術(shù)、創(chuàng)傷等條件下出現(xiàn)深靜脈血栓。 實(shí)驗(yàn)方法：肌注 3% 戊巴比妥鈉麻醉成功后將犬仰臥固定在操作臺(tái)上，任選一側(cè)股靜脈區(qū)備皮，消毒、鋪單，結(jié)扎股靜脈的近、遠(yuǎn)端，并向腔內(nèi)注入生理鹽水5 mL稀釋的凝血酶100 U。經(jīng)彩色超聲證實(shí)深靜脈血栓的形成，并通過超聲彈性成像能有效地反映不同時(shí)期血栓的彈性硬度，可以根據(jù)血栓的彈性硬度來初步判斷血栓形成及分期。 評(píng)價(jià)：該模型可以模擬臨床因長期使用糖皮質(zhì)激素及腫瘤等非外傷手術(shù)等因素造成的自發(fā)性深靜脈血栓。 機(jī)械損傷法 血管內(nèi)皮損傷和血管、肌肉、骨骼等組織聯(lián)合損傷都容易造成患者出現(xiàn)深靜脈血栓。目前研究手術(shù)和創(chuàng)傷造成的深靜脈血栓多用創(chuàng)傷模擬法進(jìn)行造模。 01 人工造成靜脈內(nèi)皮的損傷法 通過血管夾在靜脈壁外直接鉗夾造成對靜脈內(nèi)壁的損傷；或者用刮匙對靜脈內(nèi)壁造成損傷。有學(xué)者在阻斷下腔靜脈后，快速注入生理鹽水，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，恢復(fù)血流 25 min 后觀察到血栓形成；或用蚊式鉗在股靜脈不同位置分別鉗夾3 s，并用髖關(guān)節(jié)“人”字石膏固定的方法來制備 DVT 動(dòng)物模型。 評(píng)價(jià)：該方法常用于研究深靜脈血栓和炎癥及炎癥因子之間的關(guān)系。 02 機(jī)械擊打裝置法 通過物理創(chuàng)傷可建立具有骨科臨床特點(diǎn)的創(chuàng)傷性肢體DVT動(dòng)物模型。 操作方法：是用定量打擊裝置進(jìn)行擊打造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨折或損傷組織并固定模擬臨床上創(chuàng)傷—固定這一過程。具體方法是用一定能量擊打造成的骨折，行髖關(guān)節(jié)“人”字石膏固定，7 d 后用肉眼和光鏡觀察DVT形成。 評(píng)價(jià)：該方法造模成功率差異較大，但較為符合臨床實(shí)踐中創(chuàng)傷引起的深靜脈血栓形成原因。目前仍有大量學(xué)者使用該法進(jìn)行抗凝藥物機(jī)理研究和相關(guān)基因及信號(hào)傳導(dǎo)通路研究。 總結(jié) 目前建立深靜脈血栓模型，選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和建模方法眾多，各有利弊，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇。 造模方法評(píng)價(jià)：下腔靜脈結(jié)扎等方法成功率高，對血管影響大，并不能完全模擬臨床實(shí)踐中自然形成的深靜脈血栓；促凝藥物法可模擬高凝狀態(tài)形成血栓；機(jī)械打擊法最符合骨科創(chuàng)傷后血栓形成的臨床過程，但是目前造模成功概率不穩(wěn)定。 迄今為止，建模方式中大多數(shù)模型僅能體現(xiàn)血栓形成三大因素中的靜脈壁受損、靜脈血流滯緩兩因素，多無法體觀血液高凝狀態(tài)這一因素，這也是將來深靜脈血栓形成動(dòng)物模型研究中需解決的問題，此外，大部分的造模方法都適宜于研究急性和慢性DVT，而對亞急性的模型研究較少。 因此，深入了解每一種動(dòng)物模型的優(yōu)勢和缺陷，包括詳細(xì)的特征描述，對于特定的研究問題選擇合適的模型是十分必要的。直到目前為止大多數(shù)造模方法還未建立統(tǒng)一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，相信隨著醫(yī)療科學(xué)技術(shù)的發(fā)展會(huì)讓造模更加的簡單和科學(xué)，對造模過程細(xì)節(jié)的把握也將更好，我們需要根據(jù)不同的研究目的以及不同的發(fā)病機(jī)制，選用不同的造模方法。 |
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