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[交流]
脂質體遞藥系統(tǒng)的靶向修飾
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摘要：作為藥物遞送載體，脂質體（LPs）由于免疫原性低、穩(wěn)定性好、毒性低和成本低而被認為是有前途的納米藥物遞送系統(tǒng)。然而，LPs的靶向遞送效果并不理想，往往會對正常的機體細胞造成傷害，因此，如何優(yōu)化LPs藥物，使其具有靶向性仍然是當前研究的重點。本文結合近年來國內外相關研究進展，重點介紹了多肽、抗體、糖類、配體，以及核酸適配體等靶向修飾物對LPs功能的影響，并歸納總結了各種靶向修飾目前存在的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)，以期對LPs給藥系統(tǒng)的進一步研究提供科學參考及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。 脂質體（liposomes，LPs）是由脂質雙層膜構成的中空小球，在水相中，脂質分子通常會自發(fā)聚集，以疏水尾部“尾對尾”、親水頭部“肩并肩”的形式形成一個雙層的中空囊泡，其中空的部分可以裝載親水性的藥物［1］，同時，其脂雙層之間又可以裝載親脂性藥物。由于LPs的這種特點，被認為是一種良好的藥物載體。此外，LPs還有許多其他優(yōu)點，如粒徑可調控、穩(wěn)定性較好、具有緩釋作用、毒性低、生物相容性好、無免疫原性、造價低等［2］。LPs作為藥物載體，能夠很好地保護藥物免受外部介質的傷害，可以減少藥物所引起的副作用，但是由于缺乏腫瘤靶向性，使得LPs藥物難以達到良好的治療效果。為了克服該缺點，研究者們開發(fā)出多種靶向修飾LPs。腫瘤細胞會高表達一些受體，靶向LPs就是在LPs表面插入可以與腫瘤細胞表面受體識別的修飾物，利用修飾物與受體的特異性識別與結合作用，將LPs攜帶的藥物遞送進腫瘤細胞，進而達到治療腫瘤的目的［3］。根據(jù)靶向修飾物的類型不同，可分為多肽類、抗體類、糖類、配體類、核酸適配體類5個主要類型（圖1）。本文依據(jù)這5類，就近幾年來國內外有關靶向修飾LPs遞藥系統(tǒng)的研究進展進行綜述。 圖片 1 多肽修飾的脂質體 多肽分子是機體內一類重要的生物活性物質，參與機體的生長發(fā)育以及代謝，同時也是蛋白質水解的中間產物。多肽具有高特異性、高選擇性、尺寸小、易修飾和高生物相容性等優(yōu)點，此外，由于沒有三級結構，多肽通常會更加穩(wěn)定，因此，多肽在靶向給藥方面具有非常廣闊的應用前景［4］。按照多肽功能可大致分為靶向細胞多肽、細胞穿膜肽和靶向細胞穿膜肽三類［5］。 1.1 靶向細胞多肽修飾的脂質體 靶向細胞多肽（homing peptide，HP）也稱歸巢肽，是一類與腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境因子結合的特異性多肽［4］。HP已被廣泛應用于藥物遞送領域，其中以精氨酸（R）-甘氨酸（G）-天冬氨酸（D）三肽（RGD）組成的靶向活性肽最為典型。RGD能與整合素受體（αvβ3、αvβ5和αvβ1）選擇性結合，進而促使RGD修飾的LPs與細胞外基質和細胞膜發(fā)生相互作用。此外，有研究表明，相比于線狀的RGD肽，環(huán)狀的RGD肽（cyclic RGD、cRGD）與整合素結合的效果更好［6-7］。 Fu等［6］用自主合成的三肽頭部的類脂N,N-雙十四烷氧酰胺乙基三聚鳥氨酸酰胺（CDO14）和二油酰磷脂酰乙醇胺（dioleoylphosphatidyletha-nolamine，DOPE）為基礎，制備了cRGD修飾的LPs（cRGD/CD），同時搭載阿霉素（doxorubicin，DOX）用以靶向治療肺癌（圖2）。cRGD/CD-DOX的細胞攝入率更高，因為cRGD能實現(xiàn)肺癌細胞靶向性，同時CDO14脂質體具有酸不穩(wěn)定性，即在溶酶體的酸性環(huán)境下，能夠解組裝，并實現(xiàn)溶酶體逃逸，從而釋放DOX以達到殺死腫瘤細胞的目的。體內外研究結果均表明，相比于對照組，cRGD/CD-DOX有更強的抗腫瘤活性。 圖片 由天冬酰胺（N）-甘氨酸（G）-精氨酸（R）組成的三肽NGR可以與腫瘤細胞膜上的氨基肽酶N（aminopeptidase N，CD13）特異性結合，因此也被用于LPs靶向修飾［8］。Gu等［9］將NGR肽插入到包載紫杉醇（paclitaxel，PTX）的pH敏感LPs表面，以CD13高表達的人纖維肉瘤細胞HT-1080為實驗對象，實驗結果證實，NGR肽修飾的LPs能特異性靶向HT-1080細胞，并顯著提高LPs的抗腫瘤活性。 HP通過與細胞表面的受體結合，能有效將其修飾的LPs攜帶進入腫瘤細胞，顯示出HP修飾的LPs在腫瘤治療中具有巨大潛力。然而，目前HP修飾LPs的應用仍然受到限制，其中關鍵的問題在于這些多肽的受體主要存在于腫瘤血管內皮細胞，并不具有腫瘤治療的普適性。因此，提高對HP普適性篩選的研究十分重要。 1.2 細胞穿透肽修飾的脂質體 細胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP）是一類體積小、氨基酸序列短的多肽序列。其與脂質雙層具有高親和力，當CPP與細胞膜結合時，這些多肽序列能夠負責膜轉位，進而使CPP內化進入細胞內［10］。CPP具有將藥物載體快速、高效、無毒地輸送到細胞中的巨大前景，為解決因進入細胞受阻的治療方式提供了新方向［11］。 反式激活轉錄蛋白（transactivative transcription protein，TAT）是從人類免疫缺陷病毒中發(fā)現(xiàn)的一個富含精氨酸序列的多肽，具有CPP的性質。Kuai等［12］ 設計了一種由聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和TAT修飾的可控LPs。其中PEG由二硫鍵連接，可以保護性遮擋TAT，當添加完全裂解劑L-半胱氨酸（L-Cys）時可以斷裂二硫鍵，釋放PEG的空間位阻，從而暴露“功能分子”TAT，TAT可以提高LPs的細胞攝取，進而實現(xiàn)細胞對LPs攝入的控制。由于CPP本身缺乏靶向性，單獨修飾CPP的LPs往往無法實現(xiàn)靶向腫瘤目的，為了解決這個問題，Shi等［13］設計了一種同時具有主動靶向整合素αvβ3和細胞穿膜功能的多肽，它是由cRGD和CPP組成的串聯(lián)肽。研究結果顯示，該串聯(lián)肽修飾的紫杉醇LPs對荷瘤小鼠的抑瘤率達到85.04%，且小鼠的存活率明顯高于其他各對照組。 CPP具有很強的細胞穿透能力。用CPP修飾載藥的LPs能有效提高細胞攝入率，但是由于CPP不能特異識別腫瘤組織細胞，可能存在對正常組織細胞產生傷害的風險。因此，往往需要對CPP進行進一步的設計或是同時聯(lián)合靶向基團共修飾LPs，以達到既增強靶向作用又能提高癌細胞攝入率的目的。 1.3 靶向細胞穿膜肽修飾的脂質體 靶向細胞穿膜肽（cell-penetrating homing peptides， CPHPs）同時擁有細胞靶向和細胞穿膜的功能。Sugahara等［14］篩選出一種靶向細胞穿膜肽（internalizing RGD，iRGD），iRGD是指內化RGD，其氨基酸序列為CRGDKGPDC，能主動靶向識別高表達整合素αvβ3受體的腫瘤細胞，且具有穿膜作用。iRGD遵循多步腫瘤靶向機制，首先完整的肽結合到表達整合素αvβ3受體的細胞表面，隨后被蛋白質水解，產生CRGDK片段，CRGDK片段對整合素αvβ3受體親和力較低而對神經黏連蛋白1親和力較高，促使CRGDK從整合素αvβ3受體轉移到神經黏連蛋白1，由此產生了穿膜活性［14］。 Deng等［15］制備了iRGD修飾的包載DOX的LPs（iRGD-LTSL-DOX）。該LPs利用iRGD的靶向性和細胞穿透性，將藥物載體帶入腫瘤細胞，釋放DOX以達到殺傷腫瘤細胞的作用。體外實驗比較了對αvβ3表達程度不同的細胞靶向能力，結果顯示，iRGD-LTSL-DOX在高表達αvβ3的細胞中，其靶向能力是LTSL-DOX的1.8~2倍。該結果表明，iRGD修飾的LPs能有效靶向到腫瘤細胞中并實現(xiàn)腫瘤細胞的殺傷作用。Yu等［16］利用修飾有iRGD的空間穩(wěn)定性LPs（iRGD-SSL-DOX）進行黑色素瘤的治療。黑色素瘤細胞B16-F10過表達αv整合素受體，能識別iRGD修飾的LPs。體外以及體內實驗結果表明，iRGD修飾的LPs具有更高的腫瘤靶向性和腫瘤穿透活性。體內抗腫瘤結果表明，iRGD-SSL-DOX對B16-F10荷瘤小鼠的抗黑色素瘤作用強于SSL-DOX。 利用多肽修飾LPs將藥物輸送到癌細胞的研究越來越受關注，體內外的研究也都顯示著良好的結果［17］。多肽修飾的LPs可以增加所攜帶藥物在腫瘤細胞中的富集，提高腫瘤治療的效果，顯示出其良好的研究價值和應用前景。但是由于多肽自身存在一些限制因素，如缺乏靶向性、靶向普適性等。因此，如何解決多肽存在的限制因素是未來研究的重要關鍵。 2 抗體修飾的脂質體 抗體修飾的LPs即免疫脂質體（immunoliposomes，IL），是將單抗或抗體功能化片段插入LPs表面，借助抗體與靶細胞表面抗原特異性結合，從而使LPs遞藥系統(tǒng)富集于靶細胞，減少藥物副作用［18］。IL依據(jù)靶頭抗體可分類為完整抗體、單克隆抗體、抗體Fab片段和單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）［18-19］。其中完整抗體由于體積過于巨大，不利于LPs的體內循環(huán)，且專一性不強，所以目前很少使用完整抗體作為修飾體。 2.1 單克隆抗體修飾的脂質體 利用雜交瘤技術將骨髓瘤細胞和可分泌抗體的B淋巴細胞融合，再經過篩選和克隆化得到大量單克隆細胞株，該細胞株產生的高度均一、僅針對某一特定抗原的抗體即為單克隆抗體。單克隆抗體具有靈敏度高、特異性強、交叉反應少的優(yōu)點。 Petrilli等［20］將西妥昔單抗與荷載5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的LPs連接，制備成裝載 5-FU的IL，用于靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptors，EGFR）高表達的鱗狀細胞癌細胞SCC。通過IL與普通LPs對比研究發(fā)現(xiàn)，SCC細胞對西妥昔單抗修飾的IL的攝取是非修飾LPs的3.5倍。在體內，皮下注射IL與陰性對照相比，腫瘤體積減少了60%以上；與游離 5-FU溶液和對照LPs治療相比，腫瘤體積減少約50%。Survivin抑制劑YM155［21］是一種有前途的治療神經細胞瘤的藥物，但其利用率低限制了其使用。Gholizadeh等［21］利用二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine， DPPC）為脂質載體裝載YM155，同時修飾上抗二唾液酸神經節(jié)苷脂（monoclonal anti-disialoganglioside，GD2）單克隆抗體，使LPs具有特異性識別成神經腫瘤細胞的功能。細胞實驗結果表明，GD2修飾的LPs與成神經細胞瘤細胞的結合能力增加了4倍，并且，由于LPs的保護，使得YM155在血漿中維持較高的水平，能有效殺傷神經瘤細胞。 單克隆抗體在靶向修飾藥物載體研究方面具有較好的應用前景，利用其專一性與抗原結合的特點，可以精準地將藥物載體帶入到靶細胞內。但單克隆抗體的制備對于技術有一定的要求，這限制了其大規(guī)模的應用。此外，對于單克隆抗體自身所帶來的細胞毒性也還缺乏較為深入的研究。 2.2 抗體Fab片段修飾的脂質體 抗體Fab片段是抗體在蛋白水解酶的作用下切割而來，由重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)以及一個二硫鍵組成［18，22］。Fab片段的尺寸較小，相比于整個抗體，其擁有更高的表面密度，更多的單位面積上可結合部位數(shù)量，以及優(yōu)秀的組織穿透能力［23］。 Khan等［24］制備了可以靶向治療人表皮生長因子受體2（human EGFR 2，HER2）過表達的乳腺癌IL。LPs表面插入HER2抗體的Fab片段，同時裝載脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的siRNA用于抑制乳腺癌細胞的增殖。對HER2過表達的乳腺癌SK-BR3細胞進行治療，結果顯示，制備的FASN-siRNA修飾的LPs都表現(xiàn)出明顯更高的細胞攝取和內化效率，細胞的存活率降至20%，而對于HER-2低表達的乳腺癌MCF-7細胞，其存活率則降至36%。該結果顯示出抗體Fab片段修飾的LPs具有良好的腫瘤靶向能力。同樣針對乳腺癌，Li等［25］制備了修飾有ErbB2抗體Fab片段的LPs，可以通過乳腺癌細胞上的ErbB2受體達到靶向目的，得到較好的治療效果。 抗體Fab片段體積小、穿透力高，且由于沒有Fc片段，不會受到巨噬細胞和B細胞等免疫細胞上Fc受體的影響，能躲避機體的免疫監(jiān)控，將所攜帶的藥物載體運送至靶細胞。當然，由于沒有Fc片段，抗體Fab片段的降解速度也會加快，因此，如何提高抗體Fab片段的穩(wěn)定性，減緩其在體內的降解速度將是抗體Fab片段使用的一個亟需解決的問題。 2.3 單鏈抗體修飾的脂質體 scFv是由抗體重鏈高變區(qū)和輕鏈高變區(qū)兩部分通過一個短肽連接而成的抗體，scFv含有完整的抗原結合位點，是具有抗體活性的最小功能結構單位，因其結構穩(wěn)定、穿透能力強并且制備成本低而成為目前最先進的IL靶頭抗體形式［26］。 頭頸部鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma of head and neck，SCCHN）是世界第5大常見癌癥，由于該區(qū)域的解剖學復雜性，完全手術切除幾乎是不可能的。Wang等［27］制備了一種可以靶向SCCHN的IL，該LPs利用抗EGFR人源scFv作為靶向修飾物，包載DOX用以殺傷腫瘤細胞。體外的實驗結果顯示，相比于非靶向LPs，IL增強了SCCHN細胞的內吞作用，并顯著降低藥物遞送載體的半數(shù)抑制濃度（IC50）。小鼠實驗結果顯示，利用IL治療的小鼠中位存活時間顯著延長，且沒有明顯的全身毒性增加。Saeed等［28］利用黑色素瘤抗原A1的T細胞受體樣抗體的scFv片段，修飾包載DOX的LPs用于靶向治療黑色素瘤，通過對比非靶向LPs，黑色素瘤細胞在體外對IL的結合和內化更明顯。細胞毒性結果顯示，雖然非靶向LPs和靶向LPs體內藥代動力學相似，但是靶向LPs的蓄積量要明顯高于非靶向LPs，抗腫瘤活性也更優(yōu)于非靶向LPs。 上述研究將抗體與LPs結合，利用抗體與抗原具有強專一性，設計出針對腫瘤治療的IL，既能減少藥物的副作用，又能提高療效［18］�？贵w作為靶向修飾物制備IL似乎是提高LPs靶向不足的有效方法［19］。目前，對于IL的研究仍有不足，需要考慮到抗體的半衰期較短，且儲存條件較為苛刻，不利于LPs遞藥系統(tǒng)的大規(guī)模應用，同時，當抗體與抗原結合時，其自身就會產生細胞毒性，這些細胞毒性是否影響IL的功能還需要進一步的研究。相信隨著技術的發(fā)展，IL的臨床應用也有望成為現(xiàn)實。 3 糖基修飾的脂質體 糖類是細胞能量的主要來源，細胞通過糖酵解產生ATP來供給能量。腫瘤細胞相比于正常細胞，失去生長控制能力，因此需要攝入大量的ATP來維持生存，而細胞膜表面葡萄糖轉運體（glucose transporters，GLUT）的表達增加可以滿足這一要求，GLUT不僅特異性轉運葡萄糖，還能轉運半乳糖、甘露糖及其衍生物等［29］，同時，糖類還參與細胞的許多代謝過程。此外，基于不同細胞的特點，細胞表面還會特異性表達多種糖受體，這提示，可以將糖基作為配體來修飾LPs，實現(xiàn)靶向腫瘤細胞目的。 3.1 葡萄糖及其衍生物修飾的脂質體 葡萄糖是細胞能量來源的基本物質，一般細胞表面都會表達GLUT用于攝入葡萄糖，由于腫瘤失去生長控制能力，對于能量的需求極大，這就導致腫瘤細胞表面會過量表達GLUT來維持其能量需求，葡萄糖修飾的LPs就是利用腫瘤細胞表面過表達的GLUT為靶向目標來實現(xiàn)腫瘤細胞的精準靶向藥物遞送［30］。Mu等［31］設計了一種新型功能性葡萄糖偶聯(lián)材料TPGS1000-Glu，由葡萄糖衍生物 4-氨基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（4-aminophenyl-β-D-glucopyranoside，Glu）和維生素E衍生物D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS1000）組成，Glu具有腫瘤靶向性，TPGS1000具有抑制腫瘤藥物外排和改善藥物溶解性的作用，TPGS1000-Glu通過插入到LPs以實現(xiàn)腫瘤靶向的目的，同時LPs攜帶表阿霉素用于治療腦膠質瘤。實驗結果表明，TPGS1000-Glu修飾的表阿霉素LPs包封率高且多分散指數(shù)小，與非靶向LPs對比，其不僅能夠跨過血腦屏障（blood brain barrier，BBB），同時具有更強的藥物攝取和抗膠質瘤作用。Shen等［32］利用烷基葡萄糖苷的葡萄糖片段作為靶向頭部對LPs進行修飾，包載雙氫青蒿素（dihy-droartemisinin，DHA）用于抗肝癌治療。實驗結果顯示，該LPs對人肝癌細胞HepG2具有良好的靶向性，抗腫瘤活性明顯增加。 利用葡萄糖作為靶向配體是一種很有前途的修飾方式，葡萄糖來源廣、價格低，且GLUT在腫瘤細胞上高表達，這為葡萄糖的應用提供了可能性。當然，目前關于葡萄糖作為靶向配體的研究還比較少，且研究多以體外實驗進行，仍需要進行更多的相關性實驗來對這種修飾方式進行檢驗。 3.2 半乳糖及其衍生物修飾的脂質體 半乳糖（galactose， Gal）是廣泛存在于奶產品或甜菜中的一種單糖，是某些糖蛋白的重要成分。肝細胞表面存在一類半乳糖受體，也被稱為唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR），可以特異性與Gal結合，以受體介導的胞吞作用大量攝入Gal進行分解代謝和再循環(huán)［33-34］。因此Gal可以作為靶向修飾物，實現(xiàn)藥物載體的肝癌細胞靶向。 Liu等［35］制備了包載去甲斑螯素片的ASGPR靶向LPs。該LPs是利用二硬脂�；字Ｒ� 醇胺-聚乙二醇（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly，DSPE-PEG）與Gal結合形成半乳糖化LPs（Gal-Lipo）。GAL-Lipo通過其LPs外側的Gal末端分子和HepG2細胞上的ASGPR選擇性結合，然后利用受體介導的胞吞作用將攜帶藥物的LPs攝入HepG2細胞內達到富集藥物的作用。體外實驗表明，相比于未經Gal修飾的LPs，GAL-Lipo被顯著地內化到HepG2細胞中，這也意味著更多的藥物能被輸送到細胞內。Wang等［36］制備了以Gal修飾的LPs，以熱激活延遲熒光（thermally activated delayed fluorescence，TADF）為熒光探針評價LPs靶向腫瘤細胞的能力，共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測結果表明，與空白PEG-DSPE修飾的LPs相比，HepG2細胞對Gal-PEG-DSPE修飾的LPs的攝取效率更高。 Gal修飾的LPs展現(xiàn)出了其優(yōu)異的肝癌細胞靶向能力，通過與ASGPR結合，將LPs以受體介導的胞吞作用攝入細胞。因此，Gal是肝癌細胞靶向載體理想的修飾物。當然，Gal修飾的LPs也存在需要解決的問題，雖然，Gal修飾的LPs可以相對精準定位于肝癌細胞，但是在肝癌治療中，如何避免對正常肝細胞損傷還需要更為深入的研究。 3.3 甘露糖及其衍生物修飾的脂質體 甘露糖（mannose，Man）是一種單糖，是多種多糖的重要組成成分，在人體代謝過程中，具有重要作用。Man可以與甘露糖受體（mannose receptor，MR）結合，用于修飾藥物載體進行癌癥治療［30］。MR是一種高效的內源性受體。其功能包括清除內源性分子、促進抗原提呈、調節(jié)細胞活化和運輸。它在腫瘤轉移和免疫逃避中也起著重要作用［37-38］。 Xiong等［38］以包載PTX的LPs為基礎，通過在LPs表面插入Man，制備了Man修飾的紫杉醇LPs （PTX-Man Lips），該LPs能夠靶向MR，用于提高PTX對MR高表達的結直腸癌的治療作用。小鼠體內實驗結果顯示，在治療21 d后，相比生理鹽水組、PTX-Lips組、Man Lips組和PTX-Lips組，PTX-Man Lips顯示出更高的抗腫瘤活性，同時與生理鹽水對照組相比，PTX-Man Lips腫瘤抑制率為69.79%。表明Man修飾的LPs有可能成為結直腸癌靶向治療的潛在給藥系統(tǒng)。 天然糖類物質具有較好的生物安全性和生物降解性，獲取來源廣，價格低廉，有良好的靶向功能，因此具有廣泛的應用前景［34］。表1例舉了以糖類為靶向修飾物的相關信息。利用細胞膜表面的糖受體與糖類物質特異性結合是該修飾的關鍵。在研究中，需要考慮細胞表面相應糖受體表達的差異性。此外，糖類修飾的LPs所產生的細胞毒性還未見系統(tǒng)性報道。目前，糖類修飾LPs的研究尚處于初步階段，仍有大量問題需要解決，但是相信隨著技術的發(fā)展，糖類修飾的LPs可以取得更大進步。 圖片 4 配體修飾的脂質體 由于癌細胞基因表達的改變，不同癌細胞會過度表達一些特殊的受體，而正常細胞低表達或不表達這些受體。因此，在LPs表面修飾上可以與這些受體結合的配體，能夠使LPs特異性地識別這些癌細胞或組織，實現(xiàn)靶向遞送［40］。目前，基于細胞表面受體特異性結合的配體研究主要集中于葉酸（folic acid，F(xiàn)A）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及轉鐵蛋白（transferrin，TF）等。 4.1 葉酸修飾的脂質體 FA是一種水溶性維生素，是機體中參與一碳單位轉移的重要輔助因子，也是基因復制的必需物質。葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)AR）是細胞有效攝入FA而特異性表達的糖蛋白膜受體，對FA具有高親和力。當FA與靶細胞上FAR特異性結合時，能通過受體介導的內吞作用被內化進入細胞，研究發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤細胞表面會高表達FAR，以便攝取更多的FA，這提示FAR可以作為潛在的靶點用于腫瘤靶向治療［41-42］。 Nguyen等［43］制備了FA修飾的靶向LPs（FA@AuNR-DOX-LPs）協(xié)同化療和光熱療法治療乳腺癌。如圖3所示，該LPs表面修飾FA，內部包裹金納米棒（AuNR）和DOX。通過對比FA修飾的LPs與非靶向LPs的實驗結果表明，F(xiàn)A修飾的LPs具有更高的細胞攝入率，表明其具有更強的靶向能力。此外，荷瘤小鼠體內實驗表明，靶向LPs聯(lián)合治療可以有效抑制腫瘤的生長。Tie等［44］則利用FA修飾的LPs（F-PLP/pBIM）遞送BIM-S基因來治療肺癌。BIM-S基因翻譯促凋亡蛋白BIM，BIM已被證明是細胞凋亡的關鍵調節(jié)因子。實驗結果顯示，F(xiàn)-PLP/pBIM能特異性抑制肺癌生長，減少腫瘤結節(jié)數(shù)，減輕腫瘤重量。 圖片 FA作為靶向修飾物的研究已經受到廣泛的關注，因為FAR在多種腫瘤細胞中高表達。許多研究證明，F(xiàn)A可以非常高效地將LPs攜帶進入腫瘤細胞。雖然，F(xiàn)A修飾的LPs研究取得了較大的進展，但是仍有一些問題有待解決，例如，F(xiàn)A修飾的LPs進入細胞后的釋放機制仍不明確，由此所帶來的可能的細胞毒性也需要進一步的闡明。 4.2 表皮生長因子修飾的脂質體 EGFR是細胞生理的重要調節(jié)因子，在細胞增殖、存活和分化過程中起著重要的調節(jié)作用［45］。當EGF結合EGFR后，會引發(fā)EGFR的二聚化和內源性激酶的激活，然后通過網格蛋白依賴的胞吞作用內化EGF。EGFR的激活通常會導致細胞生長和增殖。研究表明，當細胞發(fā)生癌變時，EGFR過表達，正常細胞一般每個細胞表達4×104~1×105個EGFR，而腫瘤細胞每個細胞可表達2×106個EGFR，導致腫瘤細胞快速增殖，這使得EGFR成為理想的靶向研究位點［46］。 Thomas等［47］報道了一種具有EGFR靶向能力的LPs（111In-EGF-LP-Dox），該LPs裝載DOX的同時進行高劑量的放射性111In標記。研究對比了EGFR高表達的MDA-MB-468和低表達的MCF-7兩種細胞的細胞攝取差異，111In-EGF-LP-Dox在MDA-MB-468細胞中攝取量更多，且聯(lián)合治療的實驗組對腫瘤細胞殺傷效果更好。Wang等［48］為了克服順鉑（cisplatin，CDDP）的毒副作用和低水溶解性，使用海藻酸鈉（sodium alginate，SA）包裹CDDP，構建了以順鉑-海藻酸鈉（CS）為偶聯(lián)物的LPs（CS-EGF-Lip），并在LPs上插入EGF用于靶向治療EGFR高表達的卵巢癌。實驗結果顯示，對比非靶向的LPs和游離的CDDP，CS-EGF-Lip能明顯抑制腫瘤的生長和遷移，基本不會影響小鼠的體重，且腎毒性較低。Huang等［49］將酵母胞嘧啶脫氨酶（yeast cytosine deaminase，F(xiàn)cy）和人表皮生長因子（human EGF，hEGF）利用基因工程技術形成融合蛋白Fcy-hEGF，然后將Fcy-hEGF插入到包裹治療用放射性核素188Re的LPs表面，構建了新型LPs（188Re-liposome-Fcy-hEGF）。融合蛋白Fcy-hEGF能夠與EGFR結合，同時，F(xiàn)cy可以將5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）酶促轉化為1 000倍毒性的5-FU以達到殺傷腫瘤細胞的效果。 4.3 轉鐵蛋白修飾的脂質體 TF是一種能夠以高親和力可逆結合三價鐵原子的蛋白質，通過與細胞膜上的轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）結合從而將結合的鐵原子內化進細胞［50］。TFR在各種正常組織上普遍表達，反映了細胞對鐵的代謝需求。多項研究表明相對于正常細胞，腫瘤細胞表面的TFR表達上調［51］，這使得TF成為精準治療的有效靶點。 Jhaveri等［52］設計了修飾有TF的LPs （TF-RES-L），將包載的藥物白藜蘆醇（resveratrol，Res）靶向到神經膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM），以實現(xiàn)腫瘤細胞的定向殺傷。細胞實驗結果顯示，當Res濃度約為 200 μmol/L時，非靶向LPs（Res-L）處理的細胞存活率為61.9%，TF-RES-L處理的細胞存活率為54.2%。體內實驗表明，TF-RES-L對裸鼠的腫瘤生長抑制作用明顯優(yōu)于對照組，表明TF的修飾可以為LPs提供有效的靶向性。全乳鐵蛋白（holo-lactoferrin，Lf）是一種天然的鐵飽和乳鐵蛋白，具有多種生理功能，可作為TFR的潛在配體［53］。Zhang等［53］利用全乳鐵蛋白修飾包載DOX的LPs（Lf-Liposome-Dox）。實驗結果顯示，該LPs不僅可以靶向蓄積在TFR高表達的腫瘤細胞中，還可以催化H2O2轉化為氧氣，能有效緩解腫瘤缺氧微環(huán)境，并可以結合在X射線（X-ray）的照射下增強其化療效果，顯著抑制小鼠體內的腫瘤生長。該實驗結果提示全乳鐵蛋白LPs有巨大的腫瘤治療潛力。 總之，依賴于受體的主動靶向LPs很有臨床應用前景，但該系統(tǒng)有一個亟需解決的問題，即受體是正常細胞存活所必需的，當以腫瘤細胞過表達的受體為靶標時，難免會因為正常細胞也存在本底水平的受體表達而被“誤傷”。雖然配體修飾的LPs仍有很多尚未解決的問題，但其已在靶向治療研究中顯示出巨大優(yōu)勢。 5 核酸適配體修飾的脂質體 核酸適配體（aptamers）是通過富集配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）從隨機的DNA或RNA文庫中篩選出來的一類具有高特異性、強親和力、能精準識別目標物的單鏈寡聚核苷酸［54-55］，aptamer可通過二、三級結構的折疊形成特定的三維空間構型與靶分子高親和性、高特異性地相互作用［56］。Aptamer的目標物具有多樣性，不僅能與小分子結合，甚至能與整個生物體結合［57］。相比于傳統(tǒng)的抗體，aptamer具有合成簡單、分子質量更低、穩(wěn)定性更高、毒性更低、程序可控等優(yōu)點［58］。此外，有研究表明，在腫瘤學領域，aptamer不會在全身給藥中刺激免疫系統(tǒng)的Fc區(qū)域，同時具有更高的腫瘤穿透性、保留性，且能夠均勻分布［59-61］。Aptamers根據(jù)其合成類型可分為DNA和RNA兩類。 5.1 DNA核酸適配體修飾的脂質體 Cao等［62］于2009年第一次利用aptamer修飾LPs，用于藥物的靶向遞送治療。該LPs包載順鉑，表面修飾有適配體AS1411（5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GGT TTT TTT TTT TT-3'）。AS1411與核仁素有很高的親和力，核仁素在多種癌細胞表面過度表達，利用這個特性，AS1411修飾的LPs可以特異靶向癌細胞表面，將殺傷性藥物富集于癌細胞內，達到精準治療的目的。Yu等［63］同樣利用適配體AS1411（5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3'）作為靶向修飾物制備出了AS1411適配體功能化LPs （AS1411/Lipo-PTX-siPLK1），該LPs同時包載有PTX和PLK1 siRNA（siPLK1）用于對乳腺癌的治療。細胞實驗結果顯示，AS1411/Lipo-PTX-siPLK1可以使MCF-7細胞的PLK1 mRNA表達下調約79%，而對照的PBS組AS1411/Lipo-PTX-siCTR（非特異性siRNA組）則無明顯的下調作用。體內的抗腫瘤活性結果顯示，經S1411/Lipo-PTX-siPLK1注射治療后，腫瘤生長明顯受到抑制，且荷瘤小鼠的存活時間延長。Ara等［64］分離到一個DNA適配體AraHH001（5'-ACG TAC CGA CTT CGT ATG CCA ACA GCC CTT TAT CCA CCT C-3'），AraHH001可以特異性識別鼠腫瘤內皮細胞（mouse tumor endothelial cells， mTECs），并利用該適配體修飾PEG化LPs給藥系統(tǒng)（APT-PEG-LPs）。研究結果表明，適配體能有效增強mTECs細胞對于APT-PEG-LPs的攝取，并在一定程度上具有內體逃逸能力。CRISPR/Cas9是一種功能強大的基因編輯工具，具有特異性強、效率高等特點［65］。Liang等［66］將CRISPR/Cas9技術與靶向修飾LPs結合，制備了一種可靶向骨肉瘤（osteosarcoma，OS）細胞的LPs遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)包裹編碼血管內皮生長因子A（vascular EGF A，VEGFA）gDNA和Cas9的CRISPR/Cas9質粒，表面修飾有靶向OS細胞的適配體LC09（5'-GCT AAG CGG GTG GGA CTT CCT AGT CCC ACC CGC TTA GCA AAG TAG CGT GCA CTT TTG-3'）。實驗結果表明，該系統(tǒng)促進了CRISPR/Cas9在肺病變的原位OS組織和轉移性OS組織中的選擇性分布，并且有效降低了VEGFA的表達和分泌，抑制了原位OS的惡性腫瘤的轉移，減少血管生成，且未檢測到毒性。Song等［67］篩選出可以靶向識別4T1細胞的適配體SRZ1（5'-CCT GAC AGT CGA GAC-N30-CAC CGG GGT CCT AGG-3'），將該適配體修飾于包載DOX的LPs，用于靶向遞送藥物到4T1細胞中以達到治療目的。實驗結果表明，SRZ1修飾后的LPs相比于空白LPs而言，其細胞攝入率更高，腫瘤殺傷力更強。 5.2 RNA核酸適配體修飾的脂質體 Baek等［68］合成了一種與前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen， PSMA）的RNA適配體（5'-GGGAGGACGAUGCGGACCGA-AAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACG-UUCCCAGACGACUCGCCCGA-3'）偶聯(lián)的LPs（DOX-Aptamosome），利用適配體與膜上抗原結合，將包載DOX的LPs內吞進前列腺癌細胞LNCaP，以殺死癌細胞。細胞實驗結果表明，對比PSMA陰性細胞PC-3，LNCaP細胞內有明顯的熒光，而PC-3細胞則沒有觀察到熒光，同時通過與缺乏PSMA適配體的對照LPs對比，發(fā)現(xiàn)DOX-Aptamosome對LNCaP細胞的毒性明顯更大。小鼠實驗結果顯示，DOX-Aptamosome主要分布在腫瘤和肝、腎中，并且隨著時間推移，肝、腎中的DOX-Aptamosome的分布在逐漸減少，小鼠體內的腫瘤體積也在減小。這些結果表明，通過將藥物包裹在RNA適配體修飾的LPs中是一種潛在的靶向給藥策略。Bandekar等［69］同樣利用PSMA適配體A10作為靶向修飾物，包載α粒子生成器225Ac，利用225Ac的高放射性實現(xiàn)殺死腫瘤細胞的目的。實驗結果表明，每個LPs表面平均結合有（9±2）個A10，平均粒徑為（107±2）nm，且能夠很好地選擇性結合、內化和殺死PSMA陽性的癌細胞。Zhen等［70］利用A10作為靶向修飾物，包載PLK1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以沉默腫瘤細胞中生存基因Polo樣蛋白激酶1，進而實現(xiàn)殺死腫瘤細胞的目的。實驗結果顯示，A10-LPs-CRISPR/Cas9遞送嵌合體能有效地靶向腫瘤細胞，在體外不僅具有顯著的基因沉默能力，同時在體內可以觀察到明顯的腫瘤消退作用，且免疫應答低。Moosavian等［71］制備了由TSA14（5'-GCTGGAGCATTTATGG-ATGAACCTTGGACGGAA-3'）修飾的包載DOX的LPs（aptamer-PL-Dox），TSA14與Tubo細胞有很高的親和力，Tubo細胞是一種從BALB-neuT小鼠乳腺癌體外建立的克隆系，過表達HER-2受體（HER2/erb-2）。通過與非靶向LPs相比，aptamer-PL-Dox在Tubo乳腺細胞系中的攝取率更高，毒性作用更強，腫瘤中Dox的蓄積也更多，抗腫瘤能力也有很大提高。Ma等［72］制備了適配體A15 （5ʹ-CCCUCCUACAUAGGG-3ʹ）修飾包載姜黃素的LPs用于前列腺癌治療。CD133是前列腺癌細胞表面高表達膜蛋白，適配體A15可以和CD133特異性結合，同時姜黃素作為一種植物化學物質在治療前列腺癌方面顯示出巨大的潛力。該LPs在體內外的實驗結果都顯示出其具有良好的靶向抗腫瘤效果。 Aptamers作為一種人工合成的短的單鏈DNA或RNA分子，可以高親和力和特異性地與靶標結合。研究表明，相比于抗體而言，aptamers較小的體積使其擁有比抗體更高的腫瘤穿透性，附著在納米顆粒表面的過程也比抗體更容易和更具重復性［61］。目前aptamers已在癌癥治療研究方面受到關注，作為一種新興的技術手段，仍有許多問題需要克服，例如，aptamers需要從隨機單鏈核酸序列文庫中篩選出來，具有很強的隨機性，無法通過人工設計，這顯著提高了aptamers的制造成本。此外，由于人體的循環(huán)系統(tǒng)中存在核糖核酸酶，因此，aptamers的穩(wěn)定性也需要評估。期望隨著研究的深入和技術的發(fā)展，aptamers的應用迎來更好的前景。 6 多靶向修飾脂質體 單一靶向修飾的LPs發(fā)展至今已經比較成熟，然而，在臨床應用中仍有不足之處。針對癌細胞受體的單靶向修飾往往會因為正常細胞也表達了相應受體而造成非選擇性的毒性。為了解決這個問題，研究者們探索出對LPs進行多靶點修飾的策略，進一步提高了LPs遞藥系統(tǒng)的精準靶向性。 甘草次酸受體（glycyrrhetinic acid recptor，GA-R）在大鼠肝實質細胞膜表面大量表達，肝癌組織中的GA-R的表達是鄰近正常肝組織的1.5~5倍［73］，單獨使用GA修飾的LPs可能會引起正常肝細胞的損傷。為了解決這個問題，Li等［74］在GA修飾DOX脂質體的基礎上，將花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）插入到LPs表面，PNA可以與癌細胞上過表達的黏蛋白1（mucin 1，MUC1）特異性結合，利用PNA和GA制成雙配體修飾的LPs（DOX-GA/PNA-Lips），從而實現(xiàn)對肝癌細胞的主動靶向，避免對正常肝細胞的傷害。以MUC1陽性肝癌細胞株SMMC07721為靶細胞的體外實驗結果表明，DOX-GA/PNA-Lips對細胞的毒性作用最強，其IC50值為（7.4±0.79）μg/L，是游離DOX的1/7，是無配體修飾LPs的1/2，是單配體修飾LPs的2/3，顯示出雙配體修飾的高靶向性和藥物傳遞效率。 多靶向修飾除了能夠提高LPs遞藥系統(tǒng)的靶向準確性，還可以被設計用于層級靶向遞送。腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，然而由于存在BBB，因此常規(guī)的LPs無法精準到達腦部腫瘤部位。Gao等［75］開發(fā)了由FA和TF雙修飾的LPs，可以實現(xiàn)多級靶向，將藥物準確的送達腦膠質瘤。TF負責將LPs特異靶向到BBB上的TFR，在穿過BBB之后，F(xiàn)A可以特異性的靶向腦膠質瘤細胞上過表達的FAR，最終達到將LPs包封的藥物運輸?shù)侥X膠質瘤的目的。Wang等［76］設計了可以靶向肝癌細胞溶酶體的LPs（Gal-Mor-LPs），該LPs表面修飾Gal和嗎啉（morpholine，Mor），內部包載姜黃素。Gal可以識別肝癌細胞上過表達的半乳糖受體，Mor可以靶向溶酶體。實驗結果顯示，Gal-Mor-LPs比LPs和Gal-LPs有著更好的溶酶體靶向性，且抗腫瘤作用也更強。 通過對LPs進行多靶向修飾設計，使LPs具有更優(yōu)異的細胞選擇性、細胞攝取或腫瘤穿透能力，在腫瘤靶向治療中顯示出巨大優(yōu)勢。但是，在設計多靶向載體時應進行多方面評估，如配體的密度、位置、與受體的親和力等對靶向效果有較大影響的因素［77］。目前，多靶向修飾已經受到研究人員的極大關注，通過在納米藥物載體表面修飾不同靶標物，不僅可以提高腫瘤靶向遞送效果，更能賦予納米藥物載體更多功能，如克服BBB和靶向細胞器等。因此，未來應更多地關注多靶向納米藥物載體的設計，以促進其臨床應用。 7 展望 隨著癌癥發(fā)病率愈來愈高，其治療方法的研究也在不斷提升，然而，癌細胞耐藥性以及復發(fā)轉移使得癌癥的根治成為難點。精準殺死癌細胞是癌癥治療的最高目標。目前化療藥物是主要的癌癥治療方法之一，但是化療藥物在產生作用時，往往會波及到正常的細胞，這使得癌癥治療的副作用比較大，所以亟需對化療藥物進行組合優(yōu)化研究。LPs作為一種藥物載體，有著巨大的應用潛力，能將藥物包裹起來，通過對LPs的靶向修飾，還可以使LPs擁有精準定位腫瘤細胞并釋放藥物的能力，增強藥物的有效利用率，減少毒副作用。 本文概述了近年來靶向修飾LPs遞送系統(tǒng)的研究進展，并對其進行了分類綜述。目前的LPs研究主要集中在對其表面進行靶向修飾，也有很多結合其他治療手段，如化療、光療、免疫療法等對腫瘤細胞進行聯(lián)合治療。雖然靶向LPs遞藥系統(tǒng)的優(yōu)點明顯，但是由于許多靶向受體在正常細胞中也存在本底表達，這導致LPs遞藥系統(tǒng)也會被正常細胞識別攝入而引起不良反應。另外，LPs遞藥系統(tǒng)的精準控制釋放也是個亟需解決的問題，若能解決上述問題，LPs遞藥系統(tǒng)的研發(fā)和臨床應用將獲得更大提升，也將進一步推動癌癥治療研究的發(fā)展。 免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者所有，如有侵權，可刪除 |
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