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Future_Eve新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
做ChIP-seq實(shí)驗(yàn)部分，目的生物是絲狀真菌，ChIP下來(lái)的DNA濃度很低無(wú)法用于測(cè)序，求助
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物種：絲狀真菌 目的IP抗體：H3K4me3 我自己大概的實(shí)驗(yàn)流程如下： 0.甘氨酸，elution buffer現(xiàn)配現(xiàn)用 1.固體平板收菌，每個(gè)重復(fù)0.4g放入-80℃冰箱保存。 2.加入1ml剛剛加過(guò)PMSF的交聯(lián)buffer（0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，1mM EDTA,1mM PMSF，PH=8)和10ul 100x蛋白酶抑制劑，組織研磨儀研磨60HZ，230秒 3.放到三角瓶里后，補(bǔ)充PMSF到5ml，加入40ul 100x蛋白酶抑制劑，加甲醛至終濃度1%，15分鐘 4.2.5M甘氨酸中止交聯(lián)至終濃度0.15M，10分鐘。 5.洗菌絲過(guò)濾后，菌絲放到吸水紙自然吸收水分5-10分鐘，切碎菌絲至15-20小塊后，加入到1ml的lysis buffer（50mM HEPES，1% triton x-100， 137mM NaCl，1mM EDTA，0.1%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS， 1mM PMSF，1ug/ml Leupepatin，1ug/ml pepstrain A,PH（KOH）=7.5)中，槍頭混勻，吸掉上清液 6.探頭式超聲破碎儀破碎，離心，取2ul進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，再取200ul上清液加RNAseA，37℃45分鐘。后加20ul 5M NaCl解交聯(lián)2小時(shí)，再DNA提取液抽提DNA跑膠，跑膠結(jié)果主帶95-600bp（探頭式超聲破碎儀我盡力了）。 7.取2.4mg的蛋白質(zhì)作為一個(gè)ip重復(fù)，0.6mg作為igg重復(fù)，補(bǔ)充lysis buffer到1ml，加入10ul 100x的蛋白酶抑制劑，加入3.5ul的abcam（貨號(hào)ab8580）的抗體，4℃旋轉(zhuǎn)孵育12小時(shí) 8.加入40ul protein A/G beads（MCE公司），4℃孵育2小時(shí) 9.用磁力架用三種洗脫緩沖液依次洗滌磁珠。(洗脫緩沖液1是lysis buffer補(bǔ)充NaCl固體至終濃度0.5M，洗脫液2：0.25M LiCl，1%NP40， 1%脫氧膽酸鈉，1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, PH=8),洗脫液3是TE緩沖液） 10.加入Elution buffer（1%SDS, 0.1M碳酸氫鈉），65℃加熱30分鐘，每5分鐘漩渦震蕩10秒再加熱 11.磁力架吸取上清到新管，加入6ul 5M NaCl，2ul 10mg/ml 蛋白酶K，65℃解交聯(lián)6小時(shí) 12.DNA提取液抽提，異丙醇和0.3M乙酸鈉沉淀DNA，用75%乙醇洗一次，最后25ul的dd水溶解DNA 13.qubit測(cè)定ip組DNA濃度為0.08ng/ul，igg為0.07ng/ul 確實(shí)ip下來(lái)東西了，但是濃度達(dá)不到建庫(kù)要求。 什么原因?qū)е碌耐郏壳蟠笊駛兘探涛遥ǹ蘅蓿〡biostar2009 |
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