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yexuqing木蟲之王 (文學(xué)泰斗)
太陽系系主任
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中國科大在基因敲入供體的優(yōu)化方面取得新進(jìn)展
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中國科大在基因敲入供體的優(yōu)化方面取得新進(jìn)展 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院梁好均教授與生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部鮑堅強研究員合作，針對目前基因敲入供體的低效率、高成本等問題，優(yōu)化并提出了一種新型的功能核酸供體，極大地提高了基因敲入的效率。研究成果以“Efficient precise integration of large DNA sequences with 3′-overhang dsDNA donors using CRISPR/Cas9”為題，于5月22日通過直投方式（DirectSubmission）發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊美國科學(xué)院院刊《PNAS》上。 CRISPR技術(shù)改變了我們操縱基因組進(jìn)行研究和基因治療的能力，使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）途徑來精確敲入基因。然而，對于基因大小的DNA供體模板，HDR途徑十分低效。目前，可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學(xué)修飾以增強供體穩(wěn)定性，供體共價連接到CRISPR系統(tǒng)上提高切割位點局部濃度等方法提高基因敲入效率。但是，這些方法具有操作困難，成本高等問題。所以，迫切需要進(jìn)一步優(yōu)化基因敲入的供體，以促進(jìn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因大小的敲入在生命科學(xué)和臨床治療中的應(yīng)用。 圖1（A）ssDNA供體基因敲入的機理；（B）dsDNA供體基因敲入的機理；（C）odsDNA的結(jié)構(gòu)；（D）odsDNA供體基因敲入的機理。 鑒于此，梁好均教授課題組深入調(diào)研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機理，結(jié)合課題組在核酸化學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)驗，在單個供體中整合ssDNA和dsDNA的獨特優(yōu)勢，設(shè)計并提出了一種具有3′懸突的dsDNA結(jié)構(gòu)（odsDNA），并將其作為供體實現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段基因敲入（LOCK）。 圖2 odsDNA的合成示意圖及用于基因敲入的三種方法。 本項工作是梁好均教授課題組繼dsDNA供體5′末端化學(xué)修飾提高基因敲入效率（Nat. Chem. Biol., 2020, 16, 387–390）和RNA介導(dǎo)的CRISPR-dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)（J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 12690–12697）之后，基因編輯方向又一重大突破。該研究提出了一種經(jīng)濟(jì)普適的方法來制備任意3′懸突長度的odsDNA供體，利用鏈中帶有連續(xù)五個硫代磷酸酯（phosphorothioate）修飾的引物通過PCR擴增目的基因序列，再通過Lambda核酸外切酶消化處理，得到具有3′懸突的odsDNA。通過比較基因大�。�1.1kb和2.5kb）的DNA供體的敲入效率，發(fā)現(xiàn)odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率，與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍，同時在許多哺乳動物細(xì)胞跨多個基因組位點中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當(dāng)利用3′單鏈懸臂與偶聯(lián)技術(shù)結(jié)合時，使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有顯著優(yōu)勢，在未來有望取代ssDNA或dsDNA供體，實現(xiàn)其他策略無法完成的大片段基因敲入。 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心博士研究生韓汶杰為該論文第一作者。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院梁好均教授和生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部鮑堅強研究員為該論文通訊作者。該項研究得到科技部和國家自然科學(xué)基金委等項目的支持。 論文鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2221127120 （合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院、生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、科研部） |
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