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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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[交流]
一文了解DNA提取常見問題
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DNA提取，是科研實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)步驟，提取DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)的檢測(cè)工作，今天小助手將常見的問題進(jìn)行了一個(gè)總結(jié)，供大家參考。 一、A260/280比值較低？或者A260/280比值較高？ 用水作為洗脫液比較偏低，或者蛋白質(zhì)殘留，但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。而比較高可能是大量RNA殘留，沒有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。 A260值提示的含量與電泳檢測(cè)時(shí)提示的含量有可見的誤差則為苯酚殘留。 二、提取的細(xì)菌基因組DNA有降解，為什么？ 確認(rèn)選用的培養(yǎng)菌體是否新鮮，如果菌體需要保存時(shí)，請(qǐng)于-80℃保存。 起始菌液量過多，導(dǎo)致菌液裂解不充分，部分DNA降解。 菌體本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再加20uL0.5M EDTA溶液來抑制內(nèi)源性核酸酶。 三、提取的基因組DNA生物活性差，為什么？ 提取的基因組DNA中鹽分濃度過高，請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書操作。 提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時(shí)間應(yīng)該嚴(yán)格遵循說明書要求進(jìn)行。 四、為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？ 在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊醇為24:1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25:24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24:1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。 |
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