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[交流]
GST純化目的蛋白降解與有雜帶
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表達(dá)載體pgex-6p-1,表達(dá)株大腸bl21(de3),誘導(dǎo)條件：16℃、0.5mm iptg、220rpm,收菌高壓破碎至溶液清亮(破菌液中加1mm dtt、1mm pmsf），上清與2ml gst樹(shù)脂4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4小時(shí)后，洗雜后用100u pp酶柱上酶切過(guò)夜，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，收集酶切樣品，洗滌、洗脫。酶切樣品超濾管濃縮（4℃離心），鑒定發(fā)現(xiàn)樣品雜帶比較多（泳道3），樣品4℃放置16小時(shí)后目的條帶明顯減少，放置48小時(shí)后目的條帶消失。對(duì)此有幾個(gè)疑問(wèn)請(qǐng)教大家： 1.從圖一泳道1.2可以看到，第二天早上收集到的酶切產(chǎn)物里，目的蛋白就已經(jīng)存在降解情況了。造成降解的原因可能會(huì)是哪些呢？會(huì)是蛋白本身不穩(wěn)定容易降解嗎？還是bl21(de3)的蛋白酶不利于目的蛋白，需要換成蛋白酶缺陷型宿主菌？還會(huì)是殘余pp酶的影響？(理論應(yīng)該全部結(jié)合到 樹(shù)脂上，但根據(jù)圖洗脫看出我的融合蛋白殘余量挺多，可能會(huì)把樹(shù)脂結(jié)合位點(diǎn)占滿(mǎn)，導(dǎo)致一些pp酶被殘留在溶液里) 2.可以看到雜蛋白挺多，這種情況怎能改進(jìn)呢？本次實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在結(jié)合洗雜洗脫溶液里加入了1mm dtt、0.1%tritonx-100. 3.針對(duì)目的蛋白上方70kd左右那個(gè)雜蛋白，初步懷疑是大腸桿菌dnak基因產(chǎn)物，根據(jù)說(shuō)明書(shū)用50mm tris-hcl、2mm atp、10mm mgso4，ph8.0(說(shuō)明用7. 4.我沒(méi)調(diào)ph）37℃加熱10分鐘，發(fā)現(xiàn)那個(gè)條帶沒(méi)有消失（圖2泳道1.2），這種情況如何去除它呢？ 5. 該基因我還構(gòu)建了pet28（his標(biāo)簽，上清表達(dá)，表達(dá)量遠(yuǎn)低于gst融合蛋白相當(dāng)）、pet32a(trxa+stag=his標(biāo)簽,胞內(nèi)上清表達(dá)，表達(dá)量和gst融合蛋白相當(dāng)），之前試過(guò)純32a，雜帶非常多，不知是不是降解原因。 我是想得到1mg左右90%純度目的蛋白，現(xiàn)在不知道是繼續(xù)磕gst還是換成his 怎么上傳不了圖片呀  |
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2樓2023-04-28 21:07:36
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