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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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蛋白實(shí)驗(yàn)|免疫共沉淀
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種利用抗原與抗體之間的專一性為基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典研究方法。 原理 如果細(xì)胞內(nèi)兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將A蛋白沉淀下來，在細(xì)胞內(nèi)與A蛋白直接相互作用的B蛋白或與其間接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下來。使用western blot檢測沉淀中是否存在B或C蛋白來確定B或C蛋白與A蛋白的相互作用。 用途 1、檢測A、B蛋白在體內(nèi)是否相互結(jié)合 2、分離與A蛋白相互作用的蛋白復(fù)合物 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn)： （1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。 步驟 一 細(xì)胞的鋪板與轉(zhuǎn)染 1、提前一晚將293T細(xì)胞鋪板至6 cm皿中，鋪板量以達(dá)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑要求為準(zhǔn)； 2、用各實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染兩皿細(xì)胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質(zhì)粒2微克。 二 免疫沉淀 1、轉(zhuǎn)染24小時后，收獲細(xì)胞，每皿加入500 μL裂解液，收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細(xì)胞； 2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心30分鐘，取400 μL上清液用于免疫沉淀，80 μL上清用作總蛋白并加入等體積的2Ⅹ loading buffer； 3、將400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中，加入0.3-0.5 μg flag抗體，4℃孵育 3-4 小時； 4、4℃，2,000 rpm，離心3分鐘，去除未結(jié)合的液體，留下beads沉淀，用預(yù)冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次，每次5分鐘； 4、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。 三 Western Blot 檢測 通過 SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對照，檢測flag-A和HA-B蛋白是否發(fā)生結(jié)合。 注意事項(xiàng) 1、對于內(nèi)源的Co-IP檢測應(yīng)該用10cm皿來培養(yǎng)目的細(xì)胞，并維持較好的生長狀態(tài)； 2、如果該實(shí)驗(yàn)用于新蛋白的鑒定，應(yīng)注意抗體重鏈和輕鏈的影響； 3、該實(shí)驗(yàn)不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。 |
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