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angnay銅蟲 (著名寫手)
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RNA干擾第3步（見下面內(nèi)容） 為什么正反向片段都要擴(kuò)增啊？
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1 確定基因中同源性小的片段做干擾載體的目的片段，防止干擾到材料中含有的其他同源基因； 2 確定干擾載體中可以用的2個(gè)酶切位點(diǎn)， 3 設(shè)計(jì)2對(duì)帶有不同酶切位點(diǎn)的引物，分別擴(kuò)增正、反向片段，并檢查序列是否正確沒有突變； 4 將正向片段連接到酶切過的干擾載體中，pcr鑒定； 5 再將反向片段連上去，pcr鑒定。 為什么第三步待干擾基因的正反向都要擴(kuò)增��？為什么要擴(kuò)增反向？不是正向才是讀碼框的方向嗎？ 謝謝大家~ |
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您好，感謝您的提問。第三步中設(shè)計(jì)2對(duì)帶有不同酶切位點(diǎn)的引物，分別擴(kuò)增正、反向片段的目的是為了檢查待干擾基因在反向鏈上是否存在同源基因。雖然基因組DNA序列通常是雙鏈結(jié)構(gòu)，但在實(shí)驗(yàn)過程中往往只考慮其中的一個(gè)單鏈，因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增過程中只需要一條模板鏈。 如果只擴(kuò)增待干擾基因的positive strand（5' -> 3'），則可能會(huì)忽略掉negative strand（3' -> 5'）上存在的同源片段，這會(huì)導(dǎo)致未預(yù)期的干擾效果。因此在進(jìn)行基因組編輯實(shí)驗(yàn)前，需要通過PCR擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證引物是否特異性，以及確保干擾載體中插入的片段與目標(biāo)基因匹配且精確無(wú)誤。如果您有任何其他問題，請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系我。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2023-04-17 15:14:34
angnay
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3樓2023-04-17 15:25:02
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在一個(gè)特定的細(xì)胞中，基因的正義鏈和反義鏈都可能會(huì)被轉(zhuǎn)錄。不過，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）通常只在一個(gè)方向上出現(xiàn)，因此主要的RNA轉(zhuǎn)錄一般都發(fā)生在正義鏈上。但是有時(shí)候，由于特定的調(diào)節(jié)機(jī)制或者緊急響應(yīng)信號(hào)，基因的反義鏈也會(huì)被轉(zhuǎn)錄。 對(duì)于“忽略掉negative strand（3' -> 5'）上存在的同源片段”的描述可能有些不夠準(zhǔn)確。實(shí)際上，在同源片段比對(duì)分析時(shí)，如果正負(fù)義鏈間有一定的差異性，則基于RNA測(cè)序的分析可能會(huì)默認(rèn)特定方向的表達(dá)量為零或極低水平。因此，在這種情況下負(fù)鏈（3' -> 5'）上存在的同源片段雖然也能夠被測(cè)序檢測(cè)到，但往往會(huì)被認(rèn)為是低表達(dá)水平或者噪聲，并未得到足夠的重視。 以上回答來(lái)自Chat GPT 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2023-04-17 15:29:08
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