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合肥肽庫(kù)生物新蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[交流]
抗體結(jié)合方法綜述
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介紹 1890年代，Emil von Behring和Kitasato Shibatasaburo首次使用“抗體”一詞來(lái)定義血清中和毒素的部分。此后，這些Y形分子在人體免疫系統(tǒng)的研究中起著中心作用。它們對(duì)與其同源抗原結(jié)合的特異性和親和力也使它們可用于診斷和治療。如今，可通過(guò)各種修改和應(yīng)用獲得定制抗體。這篇綜述試圖全面介紹各種類(lèi)型的抗體，綴合物，綴合方法，它們的優(yōu)缺點(diǎn)和用途。 抗體 抗體是可溶性Y形球蛋白，響應(yīng)于抗原的存在，由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞合成和分泌。具有可變區(qū)和高可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)（Fab）通常不考慮綴合，因?yàn)檫@會(huì)干擾表位的結(jié)合。而且，在鉸鏈區(qū)的破壞使分子具有結(jié)合的靈活性，可能破壞抗原相互作用。因此，在制備抗體-綴合物時(shí)，必須盡可能保持Fab和鉸鏈區(qū)不受干擾。 迄今為止，鑒定出的所有五類(lèi)抗體-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，診斷和治療。同樣，多克隆和單克隆（嚙齒動(dòng)物和人）抗體均已與報(bào)告系統(tǒng)偶聯(lián)。也已經(jīng)報(bào)道了與抗體片段和抗體變體的綴合。這些包括 -人骨髓瘤細(xì)胞系分泌的輕鏈（λ或κ）[ 1 ]�？乖Y(jié)合（Fab），重鏈和輕鏈的可變區(qū)（FV），重鏈的可變區(qū)（Vh）和噬菌體展示表達(dá)單鏈可變區(qū)（scFv）。[ 2 ]人源化抗體是嵌合分子，其表達(dá)與人抗體恒定域融合的嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的可變域[ 3 ]。駱駝抗體僅由重鏈組成，存在于駱駝/單峰駱駝和新世界駱駝科動(dòng)物中，例如美洲駝和羊駝[ 4 ]。它們具有高親和力，特異性，高熱穩(wěn)定性和溶解性。 普通共軛化學(xué) 抗體上結(jié)合的首選位點(diǎn)是賴(lài)氨酸的–NH 2（胺）基團(tuán)或半胱氨酸的游離–SH（巰基）基團(tuán)[ 5 ]。盡管綴合化學(xué)平等地對(duì)待所有可及殘基，但可以綴合的分子數(shù)量受到以下限制： 反應(yīng)的pH依賴(lài)性：可以標(biāo)準(zhǔn)化僅允許特定基團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)條件，以獲得最佳的Ab：報(bào)告分子比例。例如，在堿性pH下，某些脂族胺基團(tuán)的反應(yīng)性遠(yuǎn)高于其他基團(tuán)。在堿性pH下也存在總體抗體穩(wěn)定性的問(wèn)題。在這些條件下限制反應(yīng)時(shí)間至關(guān)重要，以避免抗體變質(zhì)。共軛的半胱氨酸殘基在堿性pH下易于碎裂[ 6 ]。這就是為什么大多數(shù)商業(yè)偶聯(lián)試劑盒設(shè)計(jì)為在15-30分鐘內(nèi)完成偶聯(lián)反應(yīng)，并且通常靶向賴(lài)氨酸的伯胺基的原因（請(qǐng)參見(jiàn)表5）。另一種選擇是工程改造抗體以將pI從8-9更改為5-6 [ 7 ]。這確保了抗體在結(jié)合反應(yīng)期間不會(huì)沉淀。 綴合物的大�。盒》肿樱ㄈ绨肟乖蛩幬铮┛梢砸钥贵w：綴合物::: 1：4或什至1:10的最小比例綴合。像酶這樣的較大分子的每個(gè)抗體只能被限制為兩個(gè)分子。對(duì)于寡核苷酸，該比例為1：1。 Fab中賴(lài)氨酸和半胱氨酸殘基的存在決定了Ag的結(jié)合，因此不應(yīng)進(jìn)行綴合。平均而言，IgG分子具有約80個(gè)賴(lài)氨酸殘基，其中20個(gè)存在于溶劑可及部位。半胱氨酸殘基分布更均勻，數(shù)量更少。大約16對(duì)半胱氨酸殘基以12個(gè)鏈內(nèi)和4個(gè)鏈間二硫鍵存在。鏈間半胱氨酸通常由于其溶劑可及性而成為偶聯(lián)目標(biāo)[ 8 ]。 為了增強(qiáng)綴合的功效，可以通過(guò)引入異常氨基酸或化學(xué)修飾來(lái)改變抗體。 氨基酸替代 減少不良結(jié)合的數(shù)量的一種方法是用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸。這降低了在多肽鏈的不適當(dāng)位點(diǎn)發(fā)生綴合的可能性，這些綴合破壞了抗體的結(jié)構(gòu)（并因此破壞了其親和力和/或特異性）[ 9 ]。 在抗體-藥物偶聯(lián)物使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾谷氨酰胺殘基的情況下，已采用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)修飾醛標(biāo)記的蛋白的C末端并引入非天然氨基酸（例如對(duì)乙酰基苯丙氨酸）來(lái)產(chǎn)生特異性，穩(wěn)定和高產(chǎn)的結(jié)合物[ 10 ]。 試劑性質(zhì)好處缺點(diǎn)參考Traut試劑（2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷）在pH 7.0下將伯胺轉(zhuǎn)化為巰基保持正電荷保持蛋白質(zhì)溶解度足夠的間隔臂長(zhǎng)度減少空間位阻不太通用[ 11 ]MBS（3-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯）將胺改性為巰基，與其他分子形成硫醚鍵高度穩(wěn)定的聯(lián)動(dòng)僅用于研究和診斷目的[ 12 ]SPDP（N-琥珀酰亞胺基3-（2-吡啶基二硫）丙酸酯）通過(guò)短鏈交聯(lián)劑修飾游離胺基。引入的巰基部分可通過(guò)二硫鍵連接至半胱氨酸�？梢酝ㄟ^(guò)跟蹤在343 nm處吡啶-2-硫酮的釋放來(lái)評(píng)估共軛反應(yīng)。可以通過(guò)10-50 mM DTT甚至pH 8.5的SDS-PAGE樣品上樣緩沖液輕松裂解與半胱氨酸巰基形成的二硫鍵。SPDP有多種聚乙二醇化形式，允許更長(zhǎng)的間隔臂長(zhǎng)度。由于不溶于水，應(yīng)使用高濃度的二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中的試劑將反應(yīng)混合物中的有機(jī)溶劑保持在最低水平。[ 13 ]SATA（N-琥珀酰亞胺S-乙酰硫代乙酸酯）共價(jià)修飾伯胺以生成保護(hù)的巰基。添加短鏈（2.8埃間隔臂）試劑通過(guò)添加溫和試劑（例如羥胺-HCl）進(jìn)行脫酰作用，以生成游離巰基。因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能不受影響�？梢蚤L(zhǎng)期保存巰基修飾的抗體。與其他含巰基的分子形成可裂解的二硫鍵與賴(lài)氨酸殘基的伯胺形成高度穩(wěn)定的酰胺鍵SMCC（4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）琥珀酰亞胺基環(huán)己烷-1-甲酸）同時(shí)包含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下發(fā)生，形成酰胺鍵。試劑的馬來(lái)酰亞胺部分與另一個(gè)分子在pH 6.5-7.5下的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵環(huán)己烷基團(tuán)增強(qiáng)了馬來(lái)酰亞胺衍生的硫醚的穩(wěn)定性。這些衍生物可在0.1 M磷酸鈉緩沖液（pH 7為4°C）中保存長(zhǎng)達(dá)64小時(shí)。修飾的蛋白質(zhì)也可以?xún)龈刹⒈４妫员阋院笈c含巰基的分子綴合。形成的鍵是不可裂解的，SMCC是不溶于水的。因此，應(yīng)使用試劑在DMF或DMSO中的高濃度溶液。[ 14 ]磺基SMCC還同時(shí)包含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下發(fā)生，形成酰胺鍵。試劑的馬來(lái)酰亞胺部分與另一個(gè)分子在pH 6.5-7.5下的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵由于試劑是水溶性的，因此可以在生理溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。不存在有機(jī)溶劑也可以確保蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不被擾動(dòng)，就像SMCC一樣，環(huán)己烷橋可以賦予馬來(lái)酰亞胺衍生物以穩(wěn)定性，最高可以?xún)?chǔ)存在0.1M磷酸鈉緩沖液中（pH 7在4C下）64小時(shí)綴合物通過(guò)不可裂解的鍵結(jié)合。由于不透膜，因此不能用于細(xì)胞和組織的原位交聯(lián)[ 15 ] 圖片 表1。通過(guò)不同的試劑將伯胺轉(zhuǎn)化為巰基。 抗體的化學(xué)修飾：蛋白質(zhì)中游離巰基的引入 巰基的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們可用于形成穩(wěn)定的，可裂解的二硫鍵（-SS-）。抗體中的大多數(shù)半胱氨酸已經(jīng)以二硫化物的形式存在，可用的半胱氨酸可能不在方便的位置。因此，可以通過(guò)用Traut's試劑（2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷），MBS，SPDP，SATA及其衍生物等試劑進(jìn)行修飾，將巰基引入伯胺的位置，尤其是賴(lài)氨酸殘基的位置。表1列出了這些試劑的某些功能。 圖片 圖1.將胺改性為巰基。A）與Traut試劑反應(yīng)生成游離巰基。B）使用SMCC產(chǎn)生不可裂解的巰基。C）使用馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)產(chǎn)生保護(hù)的巰基。 與抗體結(jié)合的記者系統(tǒng) 酶聯(lián)抗體 與抗體連接的酶構(gòu)成酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的基礎(chǔ)（請(qǐng)參見(jiàn)表2）。這些是IA中使用最廣泛的類(lèi)型之一，并且比RIA更安全，更容易。它們將抗體-抗原相互作用的特異性與酶測(cè)定的靈敏度結(jié)合在一起。此外，由于可以在多個(gè)孔板中進(jìn)行，因此可以同時(shí)分析多個(gè)樣品。迄今為止，已基于所使用的底物開(kāi)發(fā)了三種主要類(lèi)型的ELISA。最早的是使用比色法進(jìn)行檢測(cè)的免疫分析法。但是，此方法通常會(huì)檢測(cè)到0.01 ng至0.1 ng相對(duì)較低的抗原。使用熒光底物和化學(xué)發(fā)光底物可以提高ELISA的靈敏度。 酵素反應(yīng)部分結(jié)合方法好處缺點(diǎn)辣根過(guò)氧化物酶糖高碘酸法可量化的結(jié)果不能用于整個(gè)電池尿素酶胺類(lèi)戊二醛由于沒(méi)有內(nèi)源性脲酶活性，因此可用于全細(xì)胞交聯(lián)的特異性可能不確定堿性磷酸酶胺類(lèi)NHS，馬來(lái)酰亞胺-硫醇偶聯(lián)可量化的結(jié)果不能用于整個(gè)電池β-半乳糖苷酶胺類(lèi)4-（N-馬來(lái)酰亞胺基甲基）-環(huán)己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亞胺酯（磺基SMCC）可用于細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映了較高系統(tǒng)的真正Ab-Ag反應(yīng)，因?yàn)闆](méi)有固有的β-gal活性 圖片 表2。酶抗體結(jié)合物及其用途。 酶聯(lián)抗體的結(jié)合方法和用途 酶與抗體的綴合可以基于酶中糖或賴(lài)氨酸基團(tuán)的連接。糖蛋白上存在的糖的高碘酸鈉氧化使其易于與抗體中賴(lài)氨酸殘基的末端胺（–NH 2）反應(yīng)。這在糖蛋白和抗體之間形成穩(wěn)定的共價(jià)連接。這是將諸如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）之類(lèi)的酶與抗體偶聯(lián)的選擇方法[ 16 ]。 圖片 圖2.高碘酸鈉法在抗體的賴(lài)氨酸殘基上產(chǎn)生了酶的氧化糖和–NH 2之間的席夫堿。 脲酶與抗體的綴合已經(jīng)通過(guò)簡(jiǎn)單的戊二醛交聯(lián)完成。戊二醛，如己二酸二甲酯和同源的亞磺酸二甲酯，是同雙功能交聯(lián)劑[ 17 ]。這些分子的兩端均具有相同的活性基團(tuán)，并且具有足夠長(zhǎng)的“連接基”。這些通常用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)，因此用于抗體-酶結(jié)合。活性端基針對(duì)兩種蛋白質(zhì)上的賴(lài)氨酸和羥基賴(lài)氨酸的末端胺（-NH 2）。 使用這些交聯(lián)劑的優(yōu)點(diǎn)是易于進(jìn)行反應(yīng)。將待交聯(lián)的蛋白質(zhì)與試劑在合適的無(wú)胺緩沖液中溫育，然后通過(guò)柱色譜法分離高分子量蛋白質(zhì)。明顯的缺點(diǎn)是非特異性交聯(lián)導(dǎo)致形成不符合目的的大蛋白聚集體。 圖片 圖3.用于酶-抗體結(jié)合的同雙功能交聯(lián)劑。 脲酶結(jié)合物已用于研究[ 18 ]和一些肝炎[ 19 ]和梅毒[ 20 ]的診斷測(cè)試。脲酶活性的檢測(cè)方法包括在溴甲酚紫存在下隨著氨的析出從黃色到紫色的比色過(guò)渡。這對(duì)于確定經(jīng)驗(yàn)值很有用。但是，可以使用結(jié)合了β-半乳糖苷酶的抗體對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量，這對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞也具有較低的背景[ 21 ]。現(xiàn)在，細(xì)胞ELISA（流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記細(xì)胞的前體）更喜歡將β-半乳糖苷酶結(jié)合的抗體用于尿素酶結(jié)合的抗體。 這些結(jié)合物可用于ELISA，Western印跡/斑點(diǎn)印跡，免疫組織化學(xué)（IHC），最近還針對(duì)實(shí)體瘤[ 22 ]。 FLIA和熒光染料標(biāo)記的抗體 熒光染料具有吸收一個(gè)波長(zhǎng)的電磁輻射，然后以更長(zhǎng)的波長(zhǎng)發(fā)射該波長(zhǎng)的特性。斯托克位移對(duì)于檢測(cè)少量目標(biāo)化合物/代謝物/蛋白質(zhì)至關(guān)重要。 熒光標(biāo)記的抗體賦予結(jié)合特異性，可用于定位。在熒光標(biāo)記中，連接至熒光團(tuán)核心的琥珀酰亞胺酯官能團(tuán)靶向抗體上的伯胺，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵[ 23 ]。抗體的標(biāo)記程度取決于游離的伯胺基團(tuán)的數(shù)目以及熒光團(tuán)是否在空間上影響結(jié)合的特異性，親和力或親和力。由于可以連接到抗體的熒光團(tuán)數(shù)量是有限的，因此沒(méi)有可以與該偶聯(lián)抗體家族相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。簡(jiǎn)而言之，熒光染料標(biāo)記的抗體的問(wèn)題是熒光團(tuán)太少或過(guò)多，非特異性染色以及抗體-抗原特異性或親和力喪失[ 24]]。這就是為什么熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體更多地用于免疫組化和FACS，而不是用于定量免疫測(cè)定。表3給出了已經(jīng)與抗體綴合的天然熒光染料。 名稱(chēng)顏色λ ABSλ EM摩爾重量（Da）氨基甲基香豆素（AMCA）紫藍(lán)色353442410熒光素綠色495528390羅丹明橙子550570444藻紅蛋白橙子488575240,000異花青素遠(yuǎn)紅650660100,000 圖片 表3。天然熒光染料及其性質(zhì)。 大多數(shù)其他商業(yè)染料，包括Alexa染料，德克薩斯紅，都源自這些染料。表4列出了熒光染料及其發(fā)射波長(zhǎng)。 近紫外線可見(jiàn)近紅外阿托425阿托488異花青素阿托488阿托532半胱氨酸5半胱氨酸2阿托550阿托647dylight 405半胱氨酸3dylight 649DyLight 488半胱氨酸5阿托655DyLight 488Cy5.5dylight 549DyLight 680德州紅DyLight 800 圖片 表4�？梢耘c抗體偶聯(lián)的熒光染料。 商業(yè)試劑盒提供具有異硫氰酸酯修飾的熒光染料。這些染料可以使用“活化”試劑在一個(gè)步驟中偶聯(lián)到胺基上，該試劑通常是琥珀酰亞胺基4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酸酯（SMCC）。在高pH（通常為9.0）下，將SMCC在二甲基甲酰胺中的高濃度溶液與異硫氰酸酯修飾的熒光團(tuán)一起孵育。這會(huì)修飾抗體，并使其準(zhǔn)備好與熒光標(biāo)簽偶聯(lián)。添加標(biāo)簽，在室溫下孵育一個(gè)小時(shí)。然后，淬滅劑將未使用的熒光探針清除掉。建議通過(guò)HPLC純化標(biāo)記的抗體以去除未結(jié)合的探針。例如，Dong JX等人使用Thermo Fisher的琥珀酰亞胺基Alexa 647將抗Homer1納米抗體與Alexa 647偶聯(lián)（A20186）[25 ]。 鑭系元素標(biāo)記的抗體 熒光染料標(biāo)記的抗體的顯著缺點(diǎn)是樣品中可能存在的高背景散射（噪聲）和來(lái)自生物分子的非特異性熒光。這些會(huì)干擾測(cè)量并限制此類(lèi)探頭的使用。在這種條件下，鑭系元素綴合的抗體具有理想的熒光團(tuán)，它們具有長(zhǎng)的斯托克斯位移（Stokes'shift），并能保持毫秒級(jí)的興奮性[ 26 ]。Han G等人發(fā)表了三種結(jié)合鑭系元素和其他稀土元素的抗體方案[ 27]。對(duì)于大規(guī)模流式細(xì)胞術(shù)，F(xiàn)luidigm Corporation提供了用于偶聯(lián)抗體的試劑盒。Rosshart SP等人使用了Fluidigm Corporation的Maxpar®抗體偶聯(lián)試劑盒來(lái)研究野生小鼠出生的實(shí)驗(yàn)室小鼠的微生物群和免疫反應(yīng)[ 28 ]。 鑭系元素（有時(shí)稱(chēng)為稀土元素）是元素周期表中從原子序數(shù)57（鑭）到71（（）的14個(gè)“ f嵌段”元素的集合。其中，euro（Eu），（Dy）和g（Gd）已主要用于生物醫(yī)學(xué)成像[ 29 ]。所有這些元素都顯示出4f-5d，4f-4f躍遷，在UV范圍內(nèi)吸收，在可見(jiàn)范圍內(nèi)發(fā)射。 鑭系元素可以形成螯合物，產(chǎn)生可檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光。聚氨基羧酸鹽（PAC），例如線性乙二胺四乙酸（EDTA）和二亞乙基三胺五乙酸（DTPA）及其環(huán)狀對(duì)應(yīng)物1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）和1 4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷-1,4,8-三乙酸（DO3A）是廉價(jià)的金屬離子螯合劑，可與鑭系元素形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。綁定的順序是EDTAβ-二酮具有雙齒能力，不穩(wěn)定。但是，它們已被修飾成與鑭系元素形成3：1的絡(luò)合物，可以容納天線分子。β-二酮已經(jīng)成為DELFIA免疫測(cè)定系統(tǒng)的一部分，在該測(cè)定中，鑭系元素標(biāo)記物從非熒光螯合物免疫復(fù)合物中解離后，它們可作為溶液配體[ 26 ]。 圖片 圖4.鑭系元素的螯合劑。 鑭系元素螯合物（尤其是Eu（III）和Tb（III）的螯合物）]通過(guò)穩(wěn)定的異硫氰酸酯連接劑與帶有游離胺和/或羧基的抗體偶聯(lián)時(shí)，可檢測(cè)到少量抗原，從而使CLIA（基于化學(xué)發(fā)光的免疫測(cè)定）最敏感的免疫測(cè)定[ 30 ]這些結(jié)合物已用于臨床診斷[ 31 ]，體外DNA雜交[ 32 ]，細(xì)胞毒性測(cè)定[ 33 ]，受體-配體結(jié)合測(cè)定[ 34 ]以及作為癌癥的潛在療法[ 35 ] 。 已經(jīng)探索了其他過(guò)渡金屬用于生物測(cè)定系統(tǒng)的檢測(cè)。Meso Scale Discovery（MSD）電化學(xué)發(fā)光平臺(tái)使用釕。Chaturvedi S等人通過(guò)MSD的SULFO‐TAG™NHS-Ester試劑盒標(biāo)記了IL-6檢測(cè)抗體[ 36 ]。 其他半抗原偶聯(lián)抗體 半抗原是需要載體蛋白以引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原性小分子。雖然熒光染料可以用作半抗原，但抗體也已與半抗原（如生物素，鏈霉親和素和生物磁珠）偶聯(lián)，以用于不同技術(shù)。 生物素/鏈霉親和素偶聯(lián)的抗體 生物素和抗生物素蛋白（或抗生蛋白鏈菌素）之間的非共價(jià)相互作用具有非常高的Kd（解離常數(shù)），使兩者之間的結(jié)合幾乎不可逆[ 37 ]。因此，一種或兩種分子與抗體的綴合使其成為檢測(cè)，定量和定位ELISA和IHC中生物分子的理想選擇。 生物素具有稠合的雜環(huán)和脂肪族戊基尾巴，而抗生物素蛋白和鏈霉親和素是蛋白質(zhì)。生物素與抗體的綴合通常是通過(guò)NHS活化分子和抗體上的胺基進(jìn)行的。一些可商購(gòu)的活化生物素制劑帶有附加的連接子，可以使分子更好地定位（請(qǐng)參閱thermoscientific.com/pi）。Silva MC等人使用Thermo Scientific EZ-LinkNHS-PEG4-Biotinylation Kit標(biāo)記tau蛋白，用于生物層干涉生物傳感器測(cè)定[ 38 ]。Chaturvedi S等人將IL-6 MSD分析捕獲抗體與Thermo-Pierce的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑偶聯(lián)[ 36 ]。鏈霉親和素/抗生物素蛋白使用交聯(lián)兩個(gè)蛋白質(zhì)的雙功能試劑與抗體連接。 生物磁珠偶聯(lián)抗體 磁珠是嵌入在環(huán)氧樹(shù)脂基質(zhì)中的氧化鐵顆粒，直徑約為0.5μm。這些具有各種活化基團(tuán)，例如胺基（-NH 2），酰肼基（-N 2 H），羧基（-COOH），碘乙酰基（-CHICOO），巰基（-SH）和醛基（-CHO），可商購(gòu)獲得。增強(qiáng)抗體附著力。為了促進(jìn)正確的結(jié)合方向，也可以使用與蛋白質(zhì)A /蛋白質(zhì)G偶聯(lián)的現(xiàn)成的磁珠。 共軛物的回收利用磁體完成，從而減少了離心過(guò)程中的損失。單個(gè)磁珠可結(jié)合約50-70μg抗體。這些珠粒具有中性pH值，可溫和分離蛋白質(zhì)復(fù)合物。應(yīng)避免在反應(yīng)緩沖液和抗體溶液中使用胺，硫醇和尿素。結(jié)合BSA后，可以將甘油和疊氮化物添加到存儲(chǔ)緩沖液中，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)干擾測(cè)定。磁珠偶聯(lián)的抗體在0°C最多可穩(wěn)定12-18個(gè)月。 例如，Engle DD等人將CA19-9單克隆抗體5B1和NS19-9，EGFR克隆D38B1與Thermo Fisher M-270環(huán)氧Dynabeads偶聯(lián)以進(jìn)行免疫沉淀[ 39 ]。 寡核苷酸偶聯(lián)的抗體 ELISA與PCR的合并，產(chǎn)生了免疫PCR（iPCR），這是Sano等人于1992年首次設(shè)計(jì)的[ 40 ]。在此，針對(duì)靶抗原的抗體與特定的寡核苷酸連接�？贵w與抗原結(jié)合后，使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA，從而可以將正常ELISA檢測(cè)到的信號(hào)擴(kuò)增近100-10,000倍。然后根據(jù)結(jié)合和擴(kuò)增的寡核苷酸的數(shù)量計(jì)算抗原的水平。iPCR已用于檢測(cè)病毒和細(xì)菌抗原以及與腮腺炎相關(guān)的疾病特異性IgG [ 41盡管夾心式iPCR涉及接頭分子，例如生物素-親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)，但特定寡核苷酸的直接連接也可以與抗體偶聯(lián)。在這里，寡聚體和抗體被異雙功能交聯(lián)劑活化，該交聯(lián)劑最終結(jié)合以將前者與抗體上的胺基連接。該方法的缺點(diǎn)是鍵合對(duì)通過(guò)色譜法純化結(jié)合物所需的條件的敏感性。Expedeon的CellMosaic®，Innova ThunderLink和LightningLink提供胺偶聯(lián)的寡核苷酸和抗體。 抗體-納米粒子結(jié)合 與天然分子相比，不同分子的納米顆粒具有改善的溶解度和活性曲線。當(dāng)與抗體綴合時(shí)，它們可以用于治療或診斷目的。包括默克公司（Merck＆Co。），Invitrogen Inc.和Miltenyi Biotech [ 42 ] 在內(nèi)的多家公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了幾種綴合物。 與抗體偶聯(lián)的半導(dǎo)體納米顆粒（量子點(diǎn)）已用于生物醫(yī)學(xué)成像中。使用流行的零長(zhǎng)度交聯(lián)劑EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽）[ 43 ] 將量子點(diǎn)綴合到andies 。EDC在抗體的羧基和伯胺之間形成中性酰胺鍵。EDC是一種水溶性試劑，可以輕松添加到緩沖液中，也可以通過(guò)用水或稀酸洗滌將其除去。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可能被Fab附近的酰胺鍵的非選擇性形成所阻斷。 圖片圖5.使用EDC將報(bào)告系統(tǒng)與抗體偶聯(lián)。 同樣，膠體金納米顆粒已使用碳二亞胺方法與抗體偶聯(lián)[ 44 ]。使用檸檬酸鹽/檸康酸部分產(chǎn)生酸不穩(wěn)定鍵的不同共軛化學(xué)已用于金納米顆粒與抗體的共軛，用于診斷成像和作為藥物輸送媒介[ 45 ]。 葡聚糖結(jié)合的IgD 葡聚糖偶聯(lián)的IgD抗體首先用于研究B細(xì)胞和T細(xì)胞活化以及Ig分泌。葡聚糖是大分子，即使與（否則為非促有絲分裂的）單價(jià)Fab片段或二價(jià)抗IgM抗體偶聯(lián)時(shí)也可以觸發(fā)細(xì)胞分裂。 如今，右旋單克隆IgG被用于研究免疫球蛋白的分泌，Ig基因的類(lèi)別轉(zhuǎn)換和B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)[ 46 ]和IgE表達(dá)[ 47 ]。 市售抗體偶聯(lián)試劑盒 為了簡(jiǎn)化抗體的綴合-特別是與染料，酶和納米顆粒的綴合，市場(chǎng)上有幾種可商購(gòu)的試劑盒。盡管其中一些已在特定標(biāo)記的背景下進(jìn)行了討論，但最常用的試劑盒是使用NHS交聯(lián)化學(xué)進(jìn)行半抗原結(jié)合的試劑盒（表5）。一些試劑盒可以耐受BSA和其他蛋白質(zhì)，而其他試劑盒則需要PBS抗體，通�？梢詮纳虡I(yè)供應(yīng)商處獲得。例如，Pastushok L等人用Licor IRDye 800CW蛋白標(biāo)記試劑盒在PBS緩沖液中標(biāo)記了Fab片段或抗IgG抗體，并使用Thermo Scientific的脫鹽旋轉(zhuǎn)柱從結(jié)合物中去除了游離的IRDye800CW [ 48 ]。 公司Ab抗體反應(yīng)條件時(shí)間混合n染色劑（生物素）≤5微克/毫升可以耐受BSA，明膠，甘氨酸30分鐘處理后即可使用澤農(nóng)（瑟默·費(fèi)舍爾）≤1微克/毫升可以耐受牛血清白蛋白和污染蛋白質(zhì)（例如腹水中的蛋白質(zhì)）15分鐘處理后即可使用閃電鏈接（Expedeon）0.5毫克/毫升單獨(dú)的選項(xiàng)可用于去除BSA，甘氨酸，疊氮化物。再次，從腹水或雜交瘤上清液中分離抗體的純化方案。15（快速范圍）至3 hAlexafluor（MilliporeSigma）10-50微克/毫升可以耐受BSA和污染蛋白質(zhì)15分鐘處理。標(biāo)簽可在2.5小時(shí)內(nèi)使用Abcam≤30微克/毫升可以耐受疊氮化物，甘油，EDTA。> 20分鐘處理。標(biāo)簽在3小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備就緒LYNX（比奧拉德）0.5-1毫克/毫升緩沖液的pH值接近中性處理時(shí)間3h 圖片表5。用于將抗體與染料結(jié)合的可商購(gòu)試劑盒。 抗體結(jié)合物的純化 從游離標(biāo)記/抗體分離結(jié)合的抗體 為了確保有效使用結(jié)合的抗體，有必要純化結(jié)合物。當(dāng)要結(jié)合的標(biāo)記的大小比抗體小得多時(shí)，可以使用凝膠過(guò)濾色譜法分離未結(jié)合的標(biāo)記。將標(biāo)記的抗體與未標(biāo)記的抗體分開(kāi)更困難。為了避免這種情況，可以使用過(guò)量的標(biāo)記物來(lái)確保與抗體的結(jié)合高，并可以進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。 抗體測(cè)定：標(biāo)記比例 通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定地附著于抗體的報(bào)道分子系統(tǒng)分子的比例來(lái)確定綴合效率。這是使用光譜學(xué)或色譜法完成的。為了獲得最大效率，報(bào)道分子系統(tǒng)的濃度通常是待結(jié)合抗體濃度的十到五十倍。然后通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法將未綴合的標(biāo)記物與抗體綴合物分離。 基于比活（對(duì)于酶），熒光法（對(duì)于熒光染料）或紫外可見(jiàn)分光光度法（對(duì)于寡核苷酸）[ 49 ] 計(jì)算抗體綴合物與游離標(biāo)記的比例。將綴合物的比活或吸光度與游離標(biāo)記的比活或吸光度進(jìn)行比較，以確定綴合比（參見(jiàn)表6）。 標(biāo)簽檢測(cè)免費(fèi)標(biāo)簽結(jié)合率的測(cè)定酵素酶活性結(jié)合物的比活性/總酶的比活性–游離酶的比活性熒光染料熒光性結(jié)合物的吸光度/總標(biāo)記的吸光度-游離標(biāo)記的吸光度鑭系螯合物熒光性結(jié)合物的吸光度/總螯合物的吸光度-游離螯合物的吸光度寡核苷酸260nm處的吸光度結(jié)合物的吸光度/總寡聚物的吸光度-游離寡聚物的吸光度 圖片表6。確定各種類(lèi)型標(biāo)簽的結(jié)合率。 結(jié)合效率可以使用以下等式（A 280結(jié)合抗體/ A 280非結(jié)合抗體）X 100進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)合抗體的儲(chǔ)存 大多數(shù)抗體偶聯(lián)物制劑通常在4°C最多可穩(wěn)定六個(gè)月。不建議凍融抗體。如果要在-20°C下儲(chǔ)存偶聯(lián)物，則應(yīng)在緩沖液中加入20％甘油。熒光染料或鑭系元素螯合物標(biāo)記的抗體應(yīng)在黑暗中保存。為防止綴合的抗體制劑受到污染，可以添加防腐劑，例如0.1％的疊氮化物或硫醇汞。 抗體結(jié)合的未來(lái) 自從1942年第一個(gè)熒光團(tuán)與抗體結(jié)合以來(lái)，抗體結(jié)合物已走了很長(zhǎng)一段路。有了更好的接頭和受控的反應(yīng)，現(xiàn)在有可能設(shè)計(jì)出可以提供特定結(jié)果的結(jié)合物。在過(guò)去的二十年中，由于成功生產(chǎn)了至少兩種抗體偶聯(lián)的藥物，偶聯(lián)物的產(chǎn)生勢(shì)頭迅猛。該領(lǐng)域中的大多數(shù)研究涉及簡(jiǎn)單的綴合化學(xué)以產(chǎn)生具有更大柔韌性和穩(wěn)定性的抗體綴合物。利用可商購(gòu)的衍生化報(bào)告系統(tǒng)開(kāi)發(fā)單步方案對(duì)于在研究，診斷和治療中獲得更好的結(jié)果將是理想的。 免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除 |
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