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原味熒光雜交（FISH）細(xì)節(jié)求教 已有1人參與
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rt，樓主現(xiàn)在正在做FISH實驗遇到了幾個問題，想請教下各位同行。問題如下： 1. 原位雜交一般是有個帶熒光的探針和DAPI復(fù)染，那請問在激光共聚焦上看的時候是選擇熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長，還是說要包括DAPI的激發(fā)和發(fā)射波長，從而進(jìn)行圖片疊加呢？ 2. 像我們實驗室激發(fā)波長最低是488nm，明顯超過DAPI的340nm上限，那為什么我還能在激光共聚焦上看到有藍(lán)色的部分？ 3. 用DAPI復(fù)染的目的是什么？是為了觀察其他沒攜帶探針的微生物嗎？如果是，那可否不進(jìn)行復(fù)染呢？ |
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恒意賽teh 
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2樓2023-01-15 15:08:41
Davidzjy
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【答案】應(yīng)助回帖
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首先要搞清楚雜交的對象 這個實驗中雜交的對象是rRNA（即用于標(biāo)記pepins中的核糖體） 所使用的nonsense探針是前面各個rRNA探針序列的互補鏈 用于排除rDNA的干擾 明白了這塊的實驗設(shè)計 再來看圖 圖A中使用的幾種探針 都是針對細(xì)菌rRNA的探針 因此能夠看到信號 圖C中使用的nonsense探針 由于這些雜交的區(qū)域沒有對應(yīng)的DNA 自然沒有信號 說明這些前面的信號不是rDNA的干擾 （DAPI通道下能看到一些點點可能是細(xì)胞中其他含有核酸分子的微小結(jié)構(gòu) ）兩張圖的信息加起來說明這里確實聚集了不少核糖體 由此 文章中得出了這樣的結(jié)論 Fluorescence in situ hybridization (FISH) with probes specifically targeting ribosomal RNA sequences of Thiomargarita confirmed that ribosomes were indeed present and concentrated in these membrane-bound structures (Figs. 2 and S6 to S8), which were spread throughout the entire cell, including the apical buds (Fig. S8). |
8樓2023-02-05 11:59:37
恒意賽teh
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3樓2023-01-15 15:10:11
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【答案】應(yīng)助回帖
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從原理的角度講 FISH的探針通常標(biāo)記一個比較小的片段 這種熒光信號太小 在低倍鏡下很難找 DAPI這類復(fù)染劑的作用就是顯示細(xì)胞核位置的 你看復(fù)染劑的英文counterstain 其中前綴counter-表示“相反的” stain表示“染色;染料” 一般的顯微操作流程 也是先在低倍鏡下用DAPI找到細(xì)胞對好焦 然后切到高倍鏡 定下視野再切換到探針對應(yīng)的通道來觀察信號 至于最后一個問題 個人理解LZ的意思是問為什么肉眼能看到藍(lán)光打在玻片上——因為DAPI的激發(fā)光屬于紫外線范圍 而濾光片會保留光譜上與激發(fā)光相近波長的光線 因此在光譜上與紫外線相鄰的可見光（藍(lán)紫色光）就被漏過了 一個類似的例子 實驗室、醫(yī)院里常用的紫外消毒燈在工作時 肉眼看也是發(fā)藍(lán)紫色光 |
4樓2023-01-24 12:36:05
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十分感謝您的回復(fù)。另外我還有個小問題想再請教下：就是我下面A圖是雜交的情況，而C圖是無義雜交（沒雜交的），就是我不太明白這兩個有什么差別？明明都有染色，只是一個有亮點，一個沒有，但這樣會影響我們找到目標(biāo)微生物嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2023-01-28 19:25:38
Davidzjy
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6樓2023-02-01 13:12:50
7樓2023-02-03 10:33:45
9樓2023-03-01 21:40:28
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10樓2023-04-02 15:16:10
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