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讀書(shū)ingbs新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
載體構(gòu)建，overlap pcr 已有2人參與
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有沒(méi)有大佬能解答我一個(gè)問(wèn)題， 就是我想構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)載體，然后用來(lái)侵染四突，現(xiàn)在我這邊就是想雙酶切一個(gè)現(xiàn)有載體，得到一個(gè)帶強(qiáng)啟動(dòng)子的載體，然后把目的基因和3×FLAG連起來(lái)，再和帶強(qiáng)啟動(dòng)子的載體連接起來(lái)，但是現(xiàn)在我的基因老是擴(kuò)不出來(lái)，我用的方法是overlap pcr，不知道大家有沒(méi)有更好的辦法，孩子快急禿了 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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就是梯度pcr，退火溫度啥的都試了，cDNA也是對(duì)的，但是怎么擴(kuò)都擴(kuò)不出來(lái)，正對(duì)照是有條帶的 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2022-11-26 17:42:33
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3樓2022-11-27 13:58:18
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4樓2022-11-27 19:07:04
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1KB左右理論上P起來(lái)應(yīng)該很容易得到，是完全沒(méi)有條帶嗎？建議首先qPCR檢測(cè)一下cDNA中目的基因的相對(duì)豐度，時(shí)間久了的話重新制樣用Trizol提RNA再逆轉(zhuǎn)一下，確保模板沒(méi)問(wèn)題。然后高保真酶看看啟動(dòng)條件是否正確，是95℃啟動(dòng)還是98℃啟動(dòng)，不行就申請(qǐng)個(gè)諾唯贊或者TAKARA的試用裝。還有就是要用合適的引物設(shè)計(jì)輔助軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物（推薦CE designer），盡量用同源重組的方法做片段插入，能提高實(shí)驗(yàn)效率，祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
5樓2022-11-27 22:42:03
6樓2022-12-02 08:54:00
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