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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 化學化工區(qū) » 高分子 » 高分子化學 » 你對小RNA了解多少呢？
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2280ke銅蟲 (小有名氣)
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你對小RNA了解多少呢？
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小RNA是指一類高度保守的長度為18-32nt的RNA分子,主要包括miRNA、siRNA、snoRNA和piRNA等,是生命活動重要的調(diào)控因子,在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。研究表明, 包括癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病在內(nèi)的多種疾病與miRNA 的調(diào)控作用密切相關(guān)。近年來, 由于小RNA測序技術(shù)的應用,越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)和功能鑒定,并將廣泛應用于疾病診斷、個性化治療和預后等領域。 技術(shù)路線 • Total RNA提取:根據(jù)不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲得高質(zhì)量的Total RNA。 • RNA質(zhì)量檢測:Nanodrop檢測RNA樣品濃度及純度;瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品完整性。 • 3’接頭連接 • RT引物雜交:RT引物封閉剩余的3’adapter,避免形成接頭自連。 • 5’接頭連接 • cDNA合成:隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。 • PCR擴增  CR富集文庫,并引入測序接頭序列及index序列。• 文庫片段選擇:通過PAGE凝膠電泳選擇目標文庫片段(138-160bp)。 • 文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。 • 上機測序:根據(jù)數(shù)據(jù)量要求將文庫pooling上機測序。 • 數(shù)據(jù)分析:下機數(shù)據(jù)由專業(yè)生物信息分析團隊進行數(shù)據(jù)分析,提供全面數(shù)據(jù)分析報告。 樣品要求 • 樣品類型:細胞、新鮮組織或RNA樣品。 • 樣品量:細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×106個細胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?00 mg的組織塊或切片,RNA樣品請?zhí)峁? μg以上的總RNA。對于特殊的微量RNA樣本,如血清、血漿、免疫共沉淀或外泌體等來源的小RNA總量200 ng以上。 • 樣品質(zhì)量:RNA無明顯降解,提取的總RNA,OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。 • 樣品保存: 細胞樣品:收集細胞至RNase Free 1.5 mL EP管,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細胞沉淀保存在-80℃。 組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。 RNA樣品:可將RNA溶于RNase Free 的超純水中,-80℃保存。 樣品保存期間避免反復凍融。 • 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰運輸。 測序方案 測序模式 SE50 測序數(shù)據(jù)量 10M reads 生物信息分析內(nèi)容 1 miRNA測序分析 2 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查; 3 比對結(jié)果質(zhì)控檢查 4 新miRNA預測 5 ncRNA注釋(rRNA / tRNA / snRNA / snoRNA /piRNA) 6 基于miRNA表達的樣品主成分分析 7 miRNA差異分析 8 差異miRNA靶基因GO功能分析 9 差異miRNA靶基因通路分析 10 差異miRNA與差異表達基因調(diào)控分析(如果有mRNA測序結(jié)果) 11 差異miRNA與差異表達基因網(wǎng)絡繪圖(如果有mRNA測序結(jié)果) |
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