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guying03鐵桿木蟲 (小有名氣)
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綜述：赤擬谷盜：精心設(shè)計(jì)遺傳工具包和隨機(jī)大規(guī)模 RNAi 篩選以研究昆蟲生物學(xué)和進(jìn)化
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赤擬谷盜：精心設(shè)計(jì)遺傳工具包和隨機(jī)大規(guī)模 RNAi 篩選以研究昆蟲生物學(xué)和進(jìn)化 赤擬谷盜（Tribolium castaneum ）是重要昆蟲模型系統(tǒng)。在研究基因功能方面，僅次于黑腹果蠅D. melanogaster。赤擬谷盜中的 RNAi 反應(yīng)異常強(qiáng)烈且具有系統(tǒng)性，它似乎可以針對(duì)所有細(xì)胞類型和過程。作為一種獨(dú)特的新興模式生物，赤擬谷盜提供了短時(shí)間、低成本大規(guī)模 RNAi 篩選的機(jī)會(huì)，該篩選基于針對(duì)所有基因，只需將dsRNA其注入體腔。赤擬谷盜于飼養(yǎng)，相對(duì)較短的世代時(shí)間滿足了完善的轉(zhuǎn)基因和基因組編輯方法。因此，許多轉(zhuǎn)基因工具，如UAS/Gal4、Cre/Lox、成像線和增強(qiáng)子陷阱線已經(jīng)可用。赤擬谷盜幾十年來一直是一個(gè)遺傳實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，現(xiàn)在已成為分子和反向遺傳學(xué)以及體內(nèi)成像的主力。與黑腹果蠅相比，這種甲蟲的發(fā)育和一般生物學(xué)的許多方面都更具昆蟲特征. 因此，通常利用在果蠅中已被充分研究的基因作為直系同源物，在甲蟲發(fā)育過程中進(jìn)行宏觀進(jìn)化比較，例如軸形成、身體分割和附肢、頭部和大腦發(fā)育。轉(zhuǎn)基因方法為體內(nèi)成像開辟了新途徑。此外，這種新興的模型系統(tǒng)是研究未在飛行中代表或難以在那里研究的過程的首選，例如胚胎外組織、隱腎器官、臭腺功能或基于 dsRNA 的殺蟲劑。 作為一種典型的全代謝昆蟲，赤擬谷盜存在幾個(gè)幼蟲階段（通常是 7 個(gè)，但饑餓時(shí)為 5 或 6 個(gè)，以及根據(jù)一些流傳的說法高達(dá) 11 齡）然后變態(tài)（圖 1）。其胚胎發(fā)育舒適區(qū)介于 22 至 32 °C 之間，25 °C 持續(xù) 7 天，32 °C 持續(xù) 3 天 。同樣，從卵到成蟲的發(fā)育隨著溫度從 22.5°C 的 74 天加速到 32°C 的約 23 天，這對(duì)于大規(guī)�；�?qū)嶒?yàn)來說足夠短了。 圖片 圖 1. 赤擬谷盜的生命周期 在許多方面，赤擬谷盜的發(fā)育和生物學(xué)比黑腹果蠅具有更典型的昆蟲特征。最近，F(xiàn)lyBase和大規(guī)模 RNAi 篩選 iBeetle 數(shù)據(jù)庫顯示，在果蠅和赤擬谷盜中，只有一半?yún)⑴c給定生物過程的基因在兩個(gè)物種中被檢測到，而另一半只在一個(gè)物種中被檢測到。這種差異可能反映了篩選方法中的生物學(xué)差異和技術(shù)差異。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了額外模型系統(tǒng)的必要性，即使對(duì)于經(jīng)過充分研究的過程。赤擬谷盜也越來越多地用于研究其他模型系統(tǒng)不太適合的基本生物學(xué)問題。 作為貯藏產(chǎn)品的主要害蟲，赤擬谷盜長期以來一直被用于研究害蟲管理和殺蟲劑抗性。雖然早期的研究集中在殺蟲劑抗性的機(jī)制和傳播上，但最近人們對(duì)使用赤擬谷盜作為模型系統(tǒng)在甲蟲和其他昆蟲中測試基于 dsRNA 的殺蟲劑產(chǎn)生了興趣。在 RNAi 介導(dǎo)的害蟲防治中，靶向害蟲物種必需基因的 dsRNA 被噴灑到植物上，或由轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生。以作物為食后，dsRNA 會(huì)在害蟲中誘導(dǎo) RNAi，導(dǎo)致其死亡。迄今為止，赤擬谷盜已作為篩選工具來鑒定最有效的靶基因。將來，它可能對(duì)優(yōu)化目標(biāo)序列和研究 RNAi 動(dòng)力學(xué)有用。由于在甲蟲和其他害蟲物種中系統(tǒng)性誘導(dǎo) RNAi 的能力差異很大，因此 dsRNA 吸收和傳播的機(jī)制也成為焦點(diǎn)，這可以在赤擬谷盜進(jìn)行深入研究。 RW Beeman 在赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)了自私 DNA 的一個(gè)最有趣的例子，它導(dǎo)致了遺傳雜交中的偏斜分離比率，命名為 MEDEA（母體效應(yīng)顯性胚胎逮捕）。這種元素可以通過垂直傳播在甲蟲種群中傳播，殺死所有沒有繼承 MEDEA 元素的后代。支撐 MEDEA 的原理由母體表達(dá)的毒素和合子表達(dá)的解毒劑組成，這些結(jié)構(gòu)應(yīng)該類似地在自然種群中傳播，并可用于特定物種抑制害蟲和媒介物種 。 主力技術(shù)：穩(wěn)健和系統(tǒng)性的 RNA 干擾 通過 RNAi 進(jìn)行基因敲除是一種在赤擬谷盜中異常穩(wěn)健和高效的技術(shù)。表型的外顯率通常接近 100%（即所有注射過的動(dòng)物及其所有后代通常都表現(xiàn)出一種表型），并且在大多數(shù)情況下觀察到與基因突變的 Null 表型相當(dāng)?shù)谋硇蛷?qiáng)度，例如對(duì)于 Hox 基因Tc-性梳減少，圖案基因Tc-Krüppel和Tc-knirps 和Tc-Distal-less ，以及眼睛顏色酶Tc-vermillion。迄今為止測試的所有組織和過程都適用于 RNAi，包括生理過程，如角質(zhì)層 和色素形成 、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌處理。已經(jīng)研究了胚胎和胚胎后模式的表皮 、胚胎外組織、大腦和肌肉形成。 重要的是，RNAi 效應(yīng)是環(huán)境的，即細(xì)胞外 dsRNA 被細(xì)胞吸收并引發(fā)沉默。因此，在注射到體腔后，dsRNA 通過血淋巴分布，似乎被整個(gè)生物體中的所有細(xì)胞吸收。當(dāng)從普遍存在的啟動(dòng)子表達(dá)的 EGFP 在所有組織中被沉默時(shí)，這一點(diǎn)得到了令人信服的證明。我們不知道還有不適合 RNAi 的組織或階段。因此，注射到任何生命階段的體腔都會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)（如果不是所有）細(xì)胞的基因敲除。胚胎可以在后期注射，早期基因功能不受影響，注射到 L5 或 L6 幼蟲中通常用于獲得影響變態(tài)的表型（圖 2）。 圖片圖 2. 角質(zhì)層表型和原位染色 RNAi 效應(yīng)甚至?xí)䦶哪赣H傳遞給后代，因此注射到雌性蛹或成蟲中也會(huì)導(dǎo)致后代被擊倒 。沉默的強(qiáng)度可以通過滴定注射 dsRNA 的濃度來調(diào)整，也可以通過在注射母體后的不同時(shí)間點(diǎn)收集胚胎來調(diào)整。dsRNAs 也被培養(yǎng)中的細(xì)胞吸收。dsRNA 攝取的分子基礎(chǔ)在赤擬谷盜中仍然是個(gè)謎，它似乎涉及網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用�？诜� dsRNA 的試驗(yàn)在不同的實(shí)驗(yàn)室中取得了不同的成功。RNAi 沉默是否可以從一個(gè)細(xì)胞傳播到另一個(gè)細(xì)胞（即全身性 RNAi 嚴(yán)格意義上的）仍有待測試�？傊瑤缀趺總�(gè)組織中的每個(gè)基因都可以在將 dsRNA 注射到栗樹的任何階段后被強(qiáng)烈沉默。 成本和時(shí)間有效的 RNAi 篩選，用于基因功能的無偏檢測 赤擬谷盜的一個(gè)突出優(yōu)勢是易于進(jìn)行大型或中型 RNAi 篩選。作為iBeetle篩選的一部分，生成了全基因組模板集合，基于這些模板可以對(duì) dsRNA 進(jìn)行商業(yè)訂購，從而無需克隆。該資源與顯微注射的簡便性（學(xué)生在一天內(nèi)學(xué)習(xí)該過程）一起，使中型或大型 RNAi 篩選能夠搜索新的基因功能或測試來自組學(xué)分析的基因列表。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，通量的上限是每個(gè)篩選器每周大約 100 個(gè)基因（包括注射、處理和篩選一個(gè)簡單的表型，如致死率）。這是一個(gè)特別復(fù)雜的篩選系統(tǒng)，因?yàn)樵S多不同類型的表型被并行評(píng)分，導(dǎo)致每個(gè)篩選器每周 21 個(gè)基因的吞吐量相對(duì)較低。根據(jù)這些經(jīng)驗(yàn)，測試所有轉(zhuǎn)錄因子（大約 800 個(gè)基因）將需要 8 到 13 周，具體取決于讀數(shù)的復(fù)雜性。因此，赤擬谷盜是一個(gè)極好的系統(tǒng)，用于快速測試許多基因的功能，例如基于組學(xué)候選基因列表。 精心設(shè)計(jì)和擴(kuò)展的轉(zhuǎn)基因工具包 赤擬谷盜是第一個(gè)成功應(yīng)用基于人工 Pax 響應(yīng)增強(qiáng)劑的 3xP3 眼標(biāo)記物的物種；3xP3 已成為許多昆蟲中轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)元素。除了piggyBac轉(zhuǎn)座子，其他轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)，如Minos 或玉米Ac/Ds（Distler 和 Klingler 未發(fā)表）也可用作轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因如在黑腹果蠅中進(jìn)行，通過將含有轉(zhuǎn)座子序列的質(zhì)粒注射到早期胚盤階段，該質(zhì)粒與作為轉(zhuǎn)座酶來源的輔助質(zhì)�；� mRNA 混合。轉(zhuǎn)基因的效率與在黑腹果蠅中使用 P 元素的效率相似，并且插入的基因組分布非常隨機(jī)。已經(jīng)建立了熱休克和 UAS/Gal4 介導(dǎo)的基因錯(cuò)誤表達(dá)，已經(jīng)測試了幾種增強(qiáng)子的活性建立了專用的體內(nèi)成像線。值得注意的是，從黑腹果蠅中提取的增強(qiáng)子和核心啟動(dòng)子在T. castaneum，因此建議使用內(nèi)源性元素。已被證明在增強(qiáng)子捕獲和遺傳構(gòu)建中有效的核心啟動(dòng)子包括Tc-hsp68和超級(jí)核心啟動(dòng)子 1 ( SCP1 )——后者在黑腹果蠅和赤擬谷盜中均具有活性。Cre-Lox 介導(dǎo)的重組正在有效地發(fā)揮作用 為腦弓等翻轉(zhuǎn)技術(shù)開辟了道路。 驅(qū)動(dòng)特定模式的增強(qiáng)子的識(shí)別和表征是許多應(yīng)用中的限制步驟。幾種預(yù)期會(huì)驅(qū)動(dòng)普遍表達(dá)的增強(qiáng)劑，例如Tc-α-微管蛋白、Tc-EF1-α和Tc-多聚泛素似乎并非在所有階段的所有細(xì)胞中都具有活性，并且經(jīng)常表現(xiàn)出斑片狀或鑲嵌狀表達(dá)（Averof 和 Bucher ，未發(fā)表）。許多通過將推定的發(fā)育增強(qiáng)子放在報(bào)告基因前面來測試它們的努力都失敗了。通過考慮染色質(zhì)可及性和使用額外的生物信息學(xué)預(yù)測，可以提高識(shí)別活性增強(qiáng)子的可能性。順式普遍表達(dá)基因的調(diào)節(jié)元件通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的幾千個(gè)堿基內(nèi)。 原文鏈接： https://doi.org/10.1186/s13227-022-00201-9 |
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