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【技術(shù)經(jīng)驗(yàn)】如何獲得高質(zhì)量的細(xì)胞上清液外泌體？
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收到不少的同學(xué)咨詢?nèi)绾潍@得高質(zhì)量的細(xì)胞上清液外泌體？這里給大家講解一些我的經(jīng)驗(yàn)，可以用來(lái)提高外泌體的質(zhì)量，供大家參考使用。 首先，從細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程下手。外泌體來(lái)自細(xì)胞，因此必須先從源頭抓起。 大部分的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中都是帶有血清的，無(wú)論是牛血清、馬血清等都是含有異源外泌體的，而我們研究的目標(biāo)通常是細(xì)胞所分泌的外泌體，因此需要盡可能的去除這些異源外泌體的干擾。那么我們需要怎么做呢？ 這里需要了解一個(gè)大原則：在細(xì)胞正常生長(zhǎng)的條件下，盡可能的減少血清外泌體或者不使用血清。方法一，可以通過(guò)超速離心的方法去除血清中外泌體，具體操作可以閱讀“無(wú)外泌體血清的制備”，實(shí)在不行就購(gòu)買商業(yè)化的去外泌體血清。方法二，通過(guò)外泌體專用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)替代完全培養(yǎng)基，維持細(xì)胞一段時(shí)間的生長(zhǎng)后收集細(xì)胞上清液。但是這兩種方法都會(huì)存在一定的不足的，去外泌體血清難以做到100%的去除的，因此即使1%的血清外泌體殘留也帶來(lái)大量的異源外泌體，而外泌體專用無(wú)血清培養(yǎng)基，也不是適合所有的細(xì)胞，常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)通常都可以維持生長(zhǎng)，而那些血清培養(yǎng)都困難的細(xì)胞就難以通用了，所以也需要一些預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索。 還有，那些DMEM、1640、F12的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是否可以替代血清或者外泌體專用無(wú)血清培養(yǎng)基呢？這樣是不行的。因?yàn)榧?xì)胞在這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的環(huán)境下，是處于饑餓狀態(tài)的，細(xì)胞會(huì)將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括外泌體）全部消耗掉的，這時(shí)的上清液中的外泌體含量大幅度下降。 接著，從細(xì)胞上清液的預(yù)處理下手。拿到細(xì)胞上清液收集后該如何處理呢？這是一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題。我們先要弄清楚細(xì)胞上清液中會(huì)有什么物質(zhì)？除了我們感興趣的外泌體外，還有少量細(xì)胞、細(xì)胞碎片、游離蛋白、脂類等。我們首要做的就是通過(guò)差速離心盡可能的去除一些雜質(zhì)物，先用800-1000g左右的離心力10分鐘有效去除細(xì)胞殘留，取上清后，再8000-10000g離心10分鐘有效去除細(xì)胞碎片物，這時(shí)候的上清液就可以進(jìn)行保存了。短期3-4天左右使用的話，則可以放到4℃的冰箱中，而長(zhǎng)期個(gè)把月后使用的話，則在-80℃進(jìn)行保存，使用前取出來(lái)4℃自然融化即可。那么這些離心操作是否可以不做呢？ 不可以的。細(xì)胞上清液處理的越早越好，處理晚時(shí)存留細(xì)胞會(huì)壞死而破碎，更多的胞內(nèi)囊泡就會(huì)釋放出來(lái)了，這時(shí)候的樣品就更加的復(fù)雜了，更不利于后期的研究了。 然后，針對(duì)細(xì)胞上清液的初步濃縮。之前在做技術(shù)答疑時(shí)，并沒(méi)有建議做初步的濃縮操作，但是后來(lái)越來(lái)越多的同學(xué)遇到在細(xì)胞外泌體提取過(guò)程中無(wú)論采取什么樣提取方法都很難看到外泌體沉淀，心中就沒(méi)了譜，下游的檢測(cè)項(xiàng)目做的更是提心吊膽。因此，在這里給出了通過(guò)超濾方法進(jìn)行濃縮處理的建議。超濾的原理就是利用一定的尺寸大小的濾膜攔住大顆粒物而放過(guò)小顆粒物的原理，在離心管中最終呈現(xiàn)上液和下游，我們?cè)诟鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母魅∷�。針�?duì)細(xì)胞上清液的特點(diǎn)，建議可以使用10 KD-100 KD之間的超濾管來(lái)進(jìn)行樣品濃縮，外泌體通常是在超濾離心管的上室中，濃縮倍數(shù)控制到5倍左右；針對(duì)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等可以將濃縮倍數(shù)提升到10倍左右，因?yàn)檫@些細(xì)胞外泌體分泌量相對(duì)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)要少很多。 最后，針對(duì)細(xì)胞上清液的外泌體的提取。這個(gè)是老生常談的問(wèn)題，這里就不再多講了。如果實(shí)驗(yàn)室有超速離心機(jī)的話，那就使用超速離心的方法，按照前文建議的預(yù)處理操作后，超離后的沉淀也會(huì)增加的，同時(shí)外泌體的質(zhì)量也會(huì)提升。如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有超離的情況下，也可以通過(guò)試劑盒的方法來(lái)提取，除了進(jìn)口品牌外，也可以使用一些國(guó)產(chǎn)試劑盒，質(zhì)量也不亞于進(jìn)口品牌的。 總結(jié)一下，為了獲得高質(zhì)量的外泌體：需要在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)減少正常血清的使用，推薦去外泌體血清或者外泌體專用無(wú)血清培養(yǎng)基；收獲到了細(xì)胞上清液時(shí)，依次離心去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片后進(jìn)行存儲(chǔ)；通過(guò)超濾方法濃縮上清液體積，提高外泌體濃度；最后通過(guò)超離或者試劑盒的方法提取外泌體。 以上的方法針對(duì)制備科研級(jí)別的外泌體質(zhì)量會(huì)大有提升，如果要針對(duì)大規(guī)模（幾升以上）的則需要結(jié)合其他的方法來(lái)操作，更多[url=https://www.judeantai.cn/productinfo/1048066.html]外泌體技術(shù)問(wèn)題可以再進(jìn)行交流。 轉(zhuǎn)載自高博科學(xué)網(wǎng)博客 |
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tzynew2樓
2022-06-13 16:33
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tzynew3樓
2022-06-13 16:34
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tzynew4樓
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tzynew6樓
2022-06-13 16:38
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