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MSC細(xì)胞培養(yǎng)說明
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臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種能分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的多能干細(xì)胞。其具有強(qiáng)大的增殖能力，且參與構(gòu)成造血微環(huán)境，因此被廣泛應(yīng)用于組織工程，細(xì)胞治療和基因治療。 操作指南 常見問題 許多科研小伙伴，在培養(yǎng)MSC細(xì)胞時(shí)，可能會(huì)遇到一些問題，在這里小逸為大家梳理一下 MSC細(xì)胞培養(yǎng)操作指南 希望對(duì)老師們有所幫助（有需要采購可以看本人介紹） 產(chǎn)品參數(shù) 01 MSC細(xì)胞基本信息 MSC人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 名稱：MSC人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 來源：臍帶 特性：貼壁生長(zhǎng) 形態(tài)：梭形細(xì)胞樣 來源：IMMOCELL 支原體：無 推薦傳代比例：1:3至1:5 推薦換液頻率：2~3次/周 凍存液：無血清凍存液，液氮儲(chǔ)存 規(guī)格：5x10^5cells/T25 培養(yǎng)條件氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃ MSC細(xì)胞培養(yǎng)基 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 完全培養(yǎng)基 流式鑒定&三系分化結(jié)果圖 MSC細(xì)胞流式鑒定結(jié)果圖 成脂 成骨 成軟骨 到貨處理 02 MSC細(xì)胞收貨處理 復(fù)蘇細(xì)胞T25瓶 復(fù)蘇MSC細(xì)胞 1.收到MSC細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生及時(shí)和我們聯(lián)系； 2.用75%酒精消毒瓶壁，將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)； 3.給收到的細(xì)胞拍照(10x,20x)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。 收貨注意事項(xiàng) 1.如果使用培養(yǎng)瓶，在將其放入培養(yǎng)箱前，應(yīng)將封口膜去掉，瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換 2.仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致 培養(yǎng)指南 03 MSC細(xì)胞培養(yǎng)操作說明 ►►► MSC細(xì)胞復(fù)蘇步驟 將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。 第二天換液并檢查MSC人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞密度。 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng) ►►► MSC細(xì)胞傳代操作 如果MSC細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng) a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。 b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細(xì)胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若MSC人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。 c、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ►►► MSC細(xì)胞凍存步驟 待MSC細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例 1.收集MSC人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 2.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量對(duì)應(yīng)加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。 3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。 ►►► 溫馨小貼士 1.為防止回收培養(yǎng)基時(shí)操作造成污染，運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）建議不再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞 2.收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代 常見問題 1、何時(shí)須更換培養(yǎng)基 視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基。 2、何時(shí)進(jìn)行傳代 細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng) 首次傳代建議1：2傳代，就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。 3、細(xì)胞凍存濃度是多少 1*10^6-1*10^7之間都可以。 4、凍存細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 如果是有要求每管要凍多少細(xì)胞，那就用1ml完培重懸后，取部分按平時(shí)方法計(jì)數(shù)，剩下的細(xì)胞按計(jì)數(shù)需要的細(xì)胞量?jī)龃婕纯?br /> 如果沒要求，那就按平時(shí)，一個(gè)皿凍一管。 5、可否使用與原先不同培養(yǎng)基 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好，最終造成細(xì)胞無法存活。 6、可否使用與原先不同血清種類 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。 7、影響細(xì)胞長(zhǎng)得慢因素 A.沒有保證密度，細(xì)胞長(zhǎng)不起來 B.操作時(shí)力度沒控制好，將細(xì)胞吹碎，狀態(tài)變差 C.血清質(zhì)量不好，影響細(xì)胞生長(zhǎng) 8、貼壁不牢的細(xì)胞到貨處理流程 A：到貨后先穩(wěn)定4-6小時(shí) 將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)全部培養(yǎng)基收集到50ml管內(nèi)，再用pbs潤(rùn)洗，pbs也收集到50ml管中。將上述上清1000rpm離心3min后，去上清，加入pbs重懸細(xì)胞沉淀。1000rpm離心3min后，去上清，加入胰酶1-2ml，重懸細(xì)胞沉淀，靜置1-2min，加入2-4ml完培終止消化1000rpm離心3min后，將細(xì)胞鋪到新的6cm皿或T25瓶中，鏡下觀察如有成團(tuán)細(xì)胞，輕輕吹開即可。 B：T25瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常步驟操作收集細(xì)胞即可。將A和B都一起鋪到同一個(gè)皿里搖勻后，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 |
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