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一芯向南新蟲 (小有名氣)
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[交流]
干貨分享 | 提取細(xì)胞核蛋白的操作步驟
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細(xì)胞核提取： 自備試劑與耗材：Triton X-100、蛋白酶抑制劑（Cocktail 等）、DTT、冷凍離心機(jī)。 操作步驟： 1） 胰酶消化法收集貼壁生長細(xì)胞，或離心法直接收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，離心后棄上清，PBS 洗滌 1 次，細(xì)胞量不小于 200萬。本人的細(xì)胞量是10cm皿長滿后（一皿600多萬細(xì)胞）分兩份。 2） 配制Buffer NA 工作液（本人使用的是omiget公司的試劑盒，貨號：Omc-06），Buffer NA 中加入 DTT，終濃度為 1 mM，再加入蛋白酶抑制劑（如 Cocktail，終濃度為 1×），充分混勻。多配一份，后面步驟講繼續(xù)使用。 3） 配制裂解液：在上一步配制好的 Buffer NA 工作液中加入 Triton X-100，終濃度為 0.2%，混勻， 用于裂解細(xì)胞。 4） Buffer NB 工作液配制：Buffer NB 中加入 DTT，終濃度為 1 mM，混勻。多配一份，后面步驟講繼續(xù)使用。 5） 細(xì)胞沉淀中加入 1 ml 的裂解液，混勻，冰上裂解 20 min，每 5 min 顛倒混勻一次。 6） 取新 EP 管，加入 1 ml Buffer NB 工作液，再將上一步中的細(xì)胞裂解液沿 EP 管壁緩慢加于 Buffer NB 工作液上（必須緩慢加入），此時管中液體分兩層，輕放于4 ℃離心1,000 rpm，10 min，此時液體依舊分上下兩層。 7） 取 0.5 ml 上層液體，轉(zhuǎn)移至新的 1.5 ml EP 管中，即為細(xì)胞漿溶液（可保存 在-80 ℃）。 8） 移除EP管中剩余液體，保留沉淀，即為粗細(xì)胞核。加入 1 ml Buffer NA 工作液，顛倒混勻，重懸細(xì)胞核。 9） 取新 EP 管，在管中加入 1 ml Buffer NB 工作液，將細(xì)胞核重懸液沿著 EP 管壁緩慢加到 Buffer NB 工作液上方，液體分兩層，1,000 rpm，4 ℃離心 10 min，棄上清，沉淀為細(xì)胞核。繼續(xù)空離，1,000 rpm，4 ℃離心 2 min，用移液槍吸盡殘余液體，沉淀即為細(xì)胞核，可以裂解，或-80 ℃保存。 10）隨后將細(xì)胞核與細(xì)胞漿用變性裂解液裂解（提取的細(xì)胞漿溶液可以 12,000×g，4 ℃離心 15 min，棄沉淀，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，用4× 的細(xì)胞裂解液，貨號：Omp-03，進(jìn)行裂解。細(xì)胞核本人用2× 的細(xì)胞裂解液，貨號Omp-01）或者RIPA 裂解液裂解，進(jìn)行WB驗證。 注意事項： 1）細(xì)胞量要夠，細(xì)胞狀態(tài)良好。 2）以上步驟第6步和第9步很關(guān)鍵，要把控好力度，必須緩慢沿著管壁加入，加入后輕放于離心機(jī)，不得震蕩、混勻等。 |
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