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[交流]
腫瘤研究必備干貨|Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)總結(jié)之操作步驟
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Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是用基質(zhì)膠（模擬細(xì)胞外基質(zhì)）將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開。即：將癌細(xì)胞放在無FBS或含低濃度FBS的培養(yǎng)液里，為了吸收營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞需消化基質(zhì)后穿過膜進(jìn)入含高濃度FBS的培養(yǎng)液，最終穿過膜的細(xì)胞量反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。遷移原理同上，區(qū)別就是遷移實(shí)驗(yàn)不需要加基質(zhì)膠。 侵襲實(shí)驗(yàn)步驟： 01 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 基質(zhì)膠需提前一晚從-20℃拿到4℃冰箱（一般將其放在冰盒里然后再放入4℃冰箱），實(shí)驗(yàn)開始前2-4h，將滅菌好的槍頭（200μL）和沒拆封的Transwell小室放入4℃預(yù)冷。 02 小室制備 將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)液1：9稀釋，需在超凈臺內(nèi)冰盒上操作，混勻后每小室分別加60μL，操作時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，否則影響細(xì)胞穿透能力。放入CO2培養(yǎng)箱中靜置2-4h，待基質(zhì)膠凝固后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 注：基質(zhì)膠買來要分裝，避免反復(fù)凍融。 每個(gè)小室內(nèi)的基質(zhì)膠不得有氣泡。 03 細(xì)胞準(zhǔn)備 將細(xì)胞狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，胰酶消化法收集到離心管，離心5min, 1000rpm，棄上清，加1mL的PBS重懸后再次離心，棄上清，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，8-10萬/孔，待用。 注：穿透能力不強(qiáng)的細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)前12h做饑餓處理，即將培養(yǎng)皿里的培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液。 04 接種細(xì)胞 24孔板加600 μL /孔（小室下層）30%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)小室內(nèi)加入200 μL已計(jì)好數(shù)的細(xì)胞懸液(8-10萬/孔，大多胃癌、肝癌、肺癌細(xì)胞8萬/孔，結(jié)腸癌細(xì)胞10萬/孔)，輕輕放入CO2培養(yǎng)箱中。 注：下層培養(yǎng)液和小室之間不得有氣泡，否則下層培養(yǎng)液的趨化作用減弱。 05 培養(yǎng)細(xì)胞 一般選擇12-48h，根據(jù)癌細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞數(shù)量而定。胃癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞48h合適。 06 染色并統(tǒng)計(jì) 48h后，取出小室， PBS洗一遍（輕柔），將小室放入新的已加入600μL的4%多聚甲醛的24孔板中固定20~30min；PBS洗兩次，放入已加有600μL 0.1%的結(jié)晶紫染色液中染色10~20min，PBS或蒸餾水洗兩次，用棉簽擦凈小室內(nèi)部細(xì)胞，晾干拍照。 Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)，說難不難，按照步驟就能做出來，但說簡單也不簡單，師弟師妹們多次未果或者多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。最后外包Omiget公司，結(jié)果還不錯(cuò)。預(yù)祝大家實(shí)驗(yàn)順利！ |
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2樓2022-06-05 12:10:29
簡單回復(fù)
2022-06-05 17:28
回復(fù)
一芯向南(金幣+1): 謝謝參與
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