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小柴不拆
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EMSA
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凝膠遷移或電泳遷移率(EMSA) 原理 凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白,目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時,依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異),和其它非相關(guān)的片段(非特異),來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。 EMSA實驗步驟 1.探針的標記 2.探針的純化 3.EMSA 膠的配制 4.EMSA結(jié)合反應(yīng) 5.電泳分析 技術(shù)要點 實驗過程包括核蛋白的提取,同位素標記/生物素/熒光素標記/與純化,凝膠電泳,膠片暴光等。在EMSA操作中會用到同位素,要注意實驗室環(huán)境和實驗員的保護。 |
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