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LS-Cui新蟲 (初入文壇)
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科普｜核酸擴(kuò)增試劑常用酶 已有1人參與
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酶，作為核酸擴(kuò)增檢測試劑的主要原材料之一，其關(guān)鍵作用不言而喻，其在分子診斷產(chǎn)品成本中更是具有舉足輕重的影響。而在“國產(chǎn)替代”、“集采”等大環(huán)境下，實(shí)現(xiàn)核心原料國產(chǎn)化的企業(yè)，也將擁有更多的機(jī)會(huì)與主動(dòng)權(quán)�，F(xiàn)在，我們不妨先看看核酸擴(kuò)增的常用酶有哪些？ 一、PCR常用酶 1.尿嘧啶DNA糖基化酶 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)又稱尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放出游離尿嘧啶，而對RNA無活性，與dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染體系。其原理如下：在PCR體系中將dTTP部分或全部替換為dUTP后，使得反應(yīng)生成含有dU堿基的擴(kuò)增產(chǎn)物，這些擴(kuò)增產(chǎn)物不同于天然模板，在進(jìn)入含有UDG酶的反應(yīng)體系時(shí)，可被UDG酶識(shí)別并切割尿嘧啶堿基與糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，而經(jīng)切割后的DNA鏈在堿性或高溫條件下易于斷裂降解，從而失去被當(dāng)作模板再擴(kuò)增的能力，因此可防止擴(kuò)增子污染 市面上的UDG酶主要有普通型和熱敏型，其中熱敏型UDG酶在室溫條件下即可催化反應(yīng)，50℃以上加熱可使其滅活，防止其降解后續(xù)PCR形成的含dU擴(kuò)增產(chǎn)物。 雖然UDG/dUTP體系具有防污染功能，但在實(shí)際測試中還得兼顧PCR的效率和靈敏度。一方面需確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物摻入足夠量的尿嘧啶堿基，從而可被UDG有效切割；另一方面也需要保證反應(yīng)體系添加的dUTP不會(huì)明顯影響PCR效率，因此dTTP和dUTP的最佳比例需通過優(yōu)化確定。 2.逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶又稱反轉(zhuǎn)錄酶，是一種RNA介導(dǎo)的DNA聚合酶，其反應(yīng)過程中體現(xiàn)出三種功能為：①以RNA作為模板合成互補(bǔ)DNA鏈 (complementary DNA, cDNA)，形成RNA:cDNA雜交鏈；②發(fā)揮RNase H活性，降解RNA  NA雜交鏈中的RNA模板；③以cDNA作為模板合成第二鏈DNA，形成雙鏈DNA。其中，RNaseH活性是逆轉(zhuǎn)錄酶的一個(gè)內(nèi)在特性，可在合成過程中同時(shí)切割RNA:cDNA雜合鏈中的RNA模板，該特性可能降低逆轉(zhuǎn)錄效率，因此在實(shí)際應(yīng)用中，常采用人工改造后的低或無RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有AMV和M-MLV，AMV分離自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶分離自莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV)，前者熱穩(wěn)定性優(yōu)于后者，但AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性也更強(qiáng)，不利于長片段cDNA合成。市面上多使用經(jīng)基因工程改造過的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其熱穩(wěn)定性改進(jìn)，可在50℃左右工作，同時(shí)RNase H活性進(jìn)一步減弱，提高了其逆轉(zhuǎn)錄效率。 3.Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是從水生噬熱桿菌(Thermus aquaticus)中提取獲得的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，可以DNA作為模板合成DNA。因其出色的熱穩(wěn)定性，可結(jié)合溫度循環(huán)變換過程，在體外完成DNA的復(fù)制。目前體外診斷試劑常用具有熱啟動(dòng)(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，該類酶通過修飾抑制其在低溫條件下的活性，防止其在未達(dá)到預(yù)設(shè)溫度時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，只有在溫度升高后，解除抑制，才釋放酶活性，從而進(jìn)入PCR循環(huán)擴(kuò)增過程。常用的TaqDNA聚合酶熱啟動(dòng)修飾方法主要有化學(xué)修飾、抗體修飾和配體修飾。 化學(xué)修飾一般采用化學(xué)反應(yīng)使一些化學(xué)小分子（如酸酐等有機(jī)物）與聚合酶上的側(cè)鏈氨基酸(賴氨酸)反應(yīng)封閉酶活性，只有溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學(xué)鍵斷裂，才表現(xiàn)出DNA聚合酶活性。一般情況下，化學(xué)修飾的聚合酶高溫啟動(dòng)時(shí)間相對較長。 抗體修飾是在Taq DNA聚合酶中添加抗體封閉其活性，使其在低溫下無法啟動(dòng)擴(kuò)增，直至反應(yīng)體系溫度升高使得抗體變性脫落后，DNA聚合酶才被釋放活性并啟動(dòng)擴(kuò)增�？贵w修飾的酶活性釋放速度快，但抗體與Taq DNA聚合酶的配比需通過優(yōu)化確定，以便兩者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡過程。 配體修飾主要借助核酸適配體封閉酶活性，該類適配體多為一段具有特異性識(shí)別功能的寡核苷酸分子，可形成特定的空間構(gòu)象，通過非共價(jià)鍵與Taq DNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制其在非許可溫度下的聚合反應(yīng)。配體修飾的聚合酶活性是可逆的，且熱激活溫度相對較低。如下圖所示的配體修飾酶，在溫度達(dá)到60℃時(shí)則釋放DNA聚合酶活性；當(dāng)溫度降低至55℃以下時(shí)，則酶活性又可被重新封閉。 4.Pfu DNA 聚合酶 Pfu DNA聚合酶來源于嗜熱古細(xì)菌(Pyrococcus furiosis)，是一種高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'→3'外切酶活性，但具有3'→5'外切酶活性，可校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物堿基錯(cuò)配率降低，且其PCR產(chǎn)物為平末端。主要用于保真度要求比較高的PCR反應(yīng)，如克隆PCR、基因定點(diǎn)突變和全基因合成等。 二、恒溫?cái)U(kuò)增常用酶 恒溫?cái)U(kuò)增的方法多種多樣，其對應(yīng)的酶體系也各有差別，且一般為多酶體系，在酶原料選擇上相比PCR復(fù)雜，下面只列舉一些主要的恒溫?cái)U(kuò)增方法相關(guān)酶。 1.LAMP相關(guān)酶 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)所用酶主要為具有鏈置換功能的DNA聚合酶。 常用酶為Bst DNA聚合酶，用于DNA鏈合成，同時(shí)具有鏈置換功能；若檢測模板為RNA，則可加入逆轉(zhuǎn)錄酶配制成RT-LAMP反應(yīng)體系。 2.TMA相關(guān)酶 依賴轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(Transcription mediated amplification, TMA)的擴(kuò)增模板為RNA或單鏈DNA，檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA。 該體系所用酶有兩種：①M(fèi)-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶：用于模板RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并在逆轉(zhuǎn)錄過程中通過引物引入轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄過程；②T7 RNA聚合酶：以逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA為模板，轉(zhuǎn)錄合成檢測產(chǎn)物RNA。 3.RPA相關(guān)酶 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是一種多酶協(xié)作的反應(yīng)體系。 該體系反應(yīng)酶包含三種：①重組酶：可與引物結(jié)合形成復(fù)合體，定位至與引物同源的靶序列，促使引物與模板結(jié)合，同時(shí)幫助DNA解鏈，以便啟動(dòng)擴(kuò)增；②單鏈DNA結(jié)合蛋白：可與被置換出的DNA單鏈結(jié)合，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)；③DNA聚合酶：如Bsu DNA聚合酶，用于DNA鏈合成，同時(shí)具有鏈置換功能。 對于RNA模板，需在反應(yīng)中加入逆轉(zhuǎn)錄酶形成RT-RPA體系；若利用標(biāo)記探針進(jìn)行檢測，還需加入核酸酶對探針序列進(jìn)行切割，常用核酸酶有核酸內(nèi)切酶 IV(Endonuclease IV, nfo)和核酸外切酶 III(Exonuclease III, exo)，或者可與CRISPS/Cas系統(tǒng)搭配使用。 4.NEAR相關(guān)酶 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)是一種基于切刻內(nèi)切酶切割特性的恒溫?cái)U(kuò)增方法。 其使用的酶有兩種：①切刻內(nèi)切酶：如Nt.BstNBI切刻內(nèi)切酶，該類酶不同于常規(guī)限制性內(nèi)切酶，其識(shí)別特定序列后僅在DNA其中一條鏈上切割形成缺口，并暴露出游離的3’端；②DNA聚合酶：如Vent (exo-) DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶，用于DNA鏈合成，同時(shí)具有鏈置換功能。 5.HDA相關(guān)酶 解旋酶依賴性擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-Dependent Amplification, HDA)也是一種多酶協(xié)作的反應(yīng)體系。 反應(yīng)體系的三個(gè)主要酶是：①解旋酶：如UvrD解旋酶，用于解開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，以便形成單鏈；②單鏈DNA結(jié)合蛋白：可與解鏈后的DNA單鏈結(jié)合，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)；③DNA聚合酶：催化合成DNA鏈，常用Bst聚合酶或Klenow聚合酶等。 6.RCA相關(guān)酶 滾環(huán)核酸擴(kuò)增技術(shù)(Rolling Circle Amplification , RCA)是模擬自然界微生物環(huán)狀DNA滾環(huán)復(fù)制過程的檢測方法，其模板進(jìn)入擴(kuò)增前需為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 RCA使用的是具有強(qiáng)鏈置換和連續(xù)合成特性的φ29 DNA聚合酶；而對于線性模板，還需利用DNA連接酶催化反應(yīng)形成環(huán)狀模板后方可進(jìn)入擴(kuò)增；此外，該方法無需使用逆轉(zhuǎn)錄酶即可用于檢測RNA。 7.SDA相關(guān)酶 鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(Strand Displacement Amplification, SDA)擴(kuò)增原理類似于NEAR，只是選擇了限制性內(nèi)切酶對DNA酶切位點(diǎn)進(jìn)行切割。 該體系含有兩種酶：①限制性內(nèi)切酶：如限制性內(nèi)切酶HincII，用于特異性識(shí)別酶切位點(diǎn)并切割DNA鏈，但由于反應(yīng)中引入化學(xué)修飾的堿基，因此只切割其中一條酶切位點(diǎn)未被修飾的DNA鏈，從而僅形成切口；②DNA聚合酶：如Klenow (exo-) DNA聚合酶，用于DNA鏈合成，同時(shí)具有鏈置換功能。 三、雙功能酶 1.Tth DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶是分離至嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)的熱穩(wěn)定性酶，兼具逆轉(zhuǎn)錄和DNA聚合酶活性。在Mn2+條件下，主要表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)錄酶活性，即以RNA為模板合成DNA；而在Mg2+條件下，則具有較強(qiáng)的DNA聚合酶活性，以DNA為模板合成DNA。由于該酶可耐受較高溫度，因此逆轉(zhuǎn)錄步驟可在較高溫度下進(jìn)行，但該酶表現(xiàn)出的活性依賴于不同的二價(jià)陽離子，在RT-PCR體系中較難兼容，其逆轉(zhuǎn)錄酶活性往往達(dá)不到預(yù)期，因此在實(shí)際使用中，有時(shí)還需添加逆轉(zhuǎn)錄酶確保逆轉(zhuǎn)錄效率。 2.RevTaq RT-PCR DNA聚合酶 RevTaq RT-PCR DNA聚合酶是經(jīng)人工定向改造后的耐高溫雙功能酶，同時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶活性。該酶不同于Tth DNA聚合酶，其逆轉(zhuǎn)錄酶活性無需Mn2+參與，在PCR循環(huán)擴(kuò)增過程中即可同步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟，實(shí)現(xiàn) “zero-step” RT-PCR。因此其逆轉(zhuǎn)錄過程可在較高溫度下進(jìn)行，引物需相應(yīng)設(shè)計(jì)為較高的Tm值。 3.Bst 3.0 DNA聚合酶 Bst 3.0 DNA聚合酶是在Bst DNA Polymerase I(大片段)基礎(chǔ)上改造并融合了新型的核酸結(jié)合域，使其等溫?cái)U(kuò)增效率提高，逆轉(zhuǎn)錄活性也增強(qiáng)，因此可直接用于單酶體系的RT-LAMP。 四、小結(jié) 對于RNA模板，通常需加入逆轉(zhuǎn)錄酶參與擴(kuò)增反應(yīng)，該酶的活性也直接決定了檢測的效率。雖然市面上也有包含逆轉(zhuǎn)錄酶活性的雙功能酶，但其應(yīng)用范圍依然較小。不過，雙功能酶實(shí)現(xiàn)RNA的單酶檢測，抑或“零步法”RT-PCR，總讓人充滿期待。 多酶系統(tǒng)直接增加了原料成本，在體系優(yōu)化上也提高了難度，但也正是多個(gè)酶的巧妙組合，才成就了各種各樣的恒溫?cái)U(kuò)增方法。 另外，人工定向改造，也為酶功能帶來了無限可能，更是在擴(kuò)增檢測方法上，給人帶去更多的想象力。 |
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