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NanoFCMlxq新蟲 (正式寫手)
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[交流]
病毒相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（二）
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今天分享一篇發(fā)表在Angewandte Chemie（2021年IF=15.336）上的文章，名為《Label-Free Analysis of Single Viruses with a Resolution Comparable to That of Electron Microscopy and the Throughput of Flow Cytometry》[1]（單個(gè)病毒的無標(biāo)記分析方法，其分辨率與電子顯微鏡媲美，通量與流式細(xì)胞術(shù)相當(dāng)）。 病毒是迄今為止我們星球上最豐富的生物實(shí)體。動物病毒眾所周知會導(dǎo)致大量致命疾病，而植物病毒病原體每年都會造成全球作物產(chǎn)量的重大損失。另一方面，病毒基因治療載體的高轉(zhuǎn)染效率及其具有精確形狀和大小的單分散結(jié)構(gòu)使病毒顆粒成為強(qiáng)大的藥物傳遞載體和通用的納米技術(shù)構(gòu)建模塊。因此，單個(gè)病毒顆粒的高分辨率、高通量分析對于病毒學(xué)研究、疾病診斷和治療以及生物技術(shù)和納米技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。 透射電子顯微鏡(TEM)歷來是確定單一病毒大小和形態(tài)的首選方法。然而，樣品制備和圖像分析所需的繁瑣過程，并且成本高，很難常規(guī)使用。近年來，許多新開發(fā)的單粒子技術(shù)已應(yīng)用于單病毒分析，如表面等離子體共振成像、低通道模式微腔、懸浮微通道諧振器、掃描探針顯微鏡、電阻脈沖傳感和納米粒子跟蹤分析(NTA)。雖然其中一些技術(shù)已被證明在各個(gè)領(lǐng)域都非常有用，但具有高靈敏度和高分辨率的方法仍有待開發(fā)。通過定量其彈性散射光強(qiáng)度，可以對單個(gè)病毒顆粒的大小和組成進(jìn)行實(shí)時(shí)、無標(biāo)記的分析。然而，散射光強(qiáng)度與粒子大小的六次方關(guān)系，以及與周圍介質(zhì)的低介電對比度，使得區(qū)分單個(gè)病毒與背景散射極具挑戰(zhàn)性。最近，有研究報(bào)道了在具有亞波長納米流體通道的單模二氧化硅纖維中對單個(gè)豇豆褪綠斑駁病毒(直徑28nm)的無標(biāo)記跟蹤。這是使用純彈性散射在單個(gè)病毒粒子水平上檢測到的最小的病毒，但可能存在樣本堵塞的嚴(yán)重問題。雖然散射強(qiáng)度尺度的六次方依賴性，干涉技術(shù)可以受益于與參考光束的混合，從而允許三次方依賴性。目前已實(shí)現(xiàn)了對噬菌體、猴病毒40(直徑45nm)空衣殼，甚至單蛋白的檢測。 流式細(xì)胞術(shù)是一種高通量的單細(xì)胞分析技術(shù)。雖然在單個(gè)病毒的檢測方面已經(jīng)做出了很大的努力，但通過無標(biāo)記光散射測量很難檢測到小于80nm的病毒。通過采用鞘流單分子熒光檢測策略，我們開發(fā)了一種高靈敏度流式檢測技術(shù)(HSFCM)，可以實(shí)時(shí)檢測直徑分別為24nm二氧化硅和7nm金顆粒的光散射。在此，我們報(bào)道了一種快速高分辨率的病毒鑒定方法，通過應(yīng)用HSFCM精確量化來自單個(gè)病毒粒子的超弱彈性散射光。 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HSFCM如圖1a所示。樣品流體被水動力聚焦到一個(gè)非常細(xì)的流(ca. 1.4um），位于錐形毛細(xì)管（內(nèi)徑40um，外徑240um）的出口處。由于樣品流位于遠(yuǎn)離比色管窗口的地方(一個(gè)250um×250um平方孔石英流通道)，并被純水鞘流包圍，通過簡單的空間掩蔽，可以有效地阻擋比色管窗口的背景散射。這里，雪崩光電二極管(APD)探測器的小活動面積(ca. 直徑180um)作為一個(gè)限制孔徑，以防止散射在探測體積之外的光到達(dá)探測器。噬菌體MS2是一種正二十面體的單鏈RNA病毒，直徑約為27nm，用來評估單病毒檢測方法的靈敏度。由于彈性光散射是一個(gè)自發(fā)的過程，因此利用較高的激發(fā)能量密度來增強(qiáng)散射光子的強(qiáng)度。將200mW、532nm連續(xù)波激光器的激發(fā)光束聚焦到直徑約為6.4um(1/e^2)的光點(diǎn)上，得到的激發(fā)能量密度為6.2×10^5Wcm^(-2)。圖1b顯示了通過0.22um過濾的超純水和MS2病毒的典型側(cè)散射(SS)信號；在這兩個(gè)信號中，觀察到大約1100個(gè)計(jì)數(shù)/bin的連續(xù)背景信號(bin寬度為100us)。信噪比(S/N)比率，計(jì)算為檢測到1min內(nèi)平均信號高度除以背景信號（噪聲）的標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算得到MS2病毒的是11，表明HSFCM將MS2病毒從背景噪聲中識別出來，有較高靈敏度。 根據(jù)瑞利散射理論，納米粒子的散射截面不僅取決于粒子的大小，還受折射率對比度的影響，折射率對比度是粒子與介質(zhì)的折射率比值。一種二氧化硅納米顆粒（折射率為1.46）在波長為532nm時(shí)，比相同尺寸的聚苯乙烯納米顆粒（折射率為1.59）散射的光少3.8倍。該病毒的確切折射率尚不清楚，但可以假定它為1.45或1.46，這與蛋白質(zhì)和DNA相似。我們用噬菌體T7，一種二十面體衣殼頭部直徑約60nm的病毒，和同樣大小的硅納米球和聚苯乙烯納米球，來評估折射率對單個(gè)病毒的光散射檢測的影響。 為了避免信號飽和，確保樣品流的激發(fā)更均勻，激光激發(fā)功率衰減到16mW，激光束聚焦到直徑為16um(1/e^2)的點(diǎn)，導(dǎo)致背景計(jì)數(shù)減少約200個(gè)計(jì)數(shù)/bin。噬菌體T7病毒粒子、60nm硅納米球和63nm聚苯乙烯納米球的典型SS信號如圖2a所示，測量的S/N比分別為94、97和635。與直徑為60±?2nm的高單分散的二氧化硅納米球相比(見支持信息，圖S1)，自然產(chǎn)生的噬菌體T7更均勻，光散射強(qiáng)度分布很窄�？紤]到散射強(qiáng)度對粒子大小的六次方依賴，T7病毒粒子散射光的12%的變異系數(shù)(CV，標(biāo)準(zhǔn)差和平均值的比值)對應(yīng)于粒徑大小的1.9%的變異，這可以歸因于實(shí)際粒徑分布和測量不確定性。T7病毒粒子和60nm二氧化硅球證實(shí)了病毒和二氧化硅納米顆粒具有相當(dāng)?shù)恼凵渎省?3nm的聚苯乙烯比60nm的硅球的散射強(qiáng)度約高6倍，這與增加5.1倍的理論預(yù)測一致。 HSFCM用于測定病毒混合物粒徑分布采用噬菌體作為模型系統(tǒng)，因?yàn)槭删w是一類最豐富的病毒，安全性高，已成為研究病毒學(xué)的基本工具。從研究最廣泛的噬菌體科、足病毒科、虹病毒科和肌病毒科中各選擇一個(gè)噬菌體，并混合。M13、T7、λ和PP01噬菌體的結(jié)構(gòu)尺寸見表1。PP01是一種T2型噬菌體，高特異性感染大腸桿菌O157：H7菌株。典型的SS信號圖如圖3a所示。SS信號面積分布直方圖顯示，盡管噬菌體T7和λ的大小差異只有4nm，但這四種病毒可以通過基線分離區(qū)分(圖3b)。有趣的是，PP01的分布是雙峰，這一特征可以歸因于尾纖維的收縮或延伸，TEM已證實(shí)。 為了從單個(gè)病毒的散射強(qiáng)度來測量其實(shí)際大小，我們構(gòu)建了5個(gè)直徑從43到113nm的單分散硅球的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。當(dāng)SS信號面積的質(zhì)心獲得的擬合高斯曲線為每個(gè)納米球群體(圖3c)繪制一個(gè)函數(shù)，直徑由透射電鏡確定(圖S3)，確定了散射強(qiáng)度對粒子大小為5.95階依賴，符合瑞利散射理論(圖3d)。利用這條校準(zhǔn)曲線，將每個(gè)單個(gè)病毒的SS信號轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的粒徑(圖3e)。M13、T7、λ和PP01噬菌體的測定粒徑分別為41.8、60.6、74.4和99.6nm。利用動態(tài)光散射(DLS)對包含這四種不同類型病毒的病毒樣本進(jìn)行了平行分析，大小分布曲線如圖3f所示。對于這四種不同類型的病毒的混合物，只觀察到一個(gè)峰(圖3f中的黑色虛線)。 表1列出了由HSFCM和DLS測量到的這四種類型的病毒的直徑，以及等效的顆粒直徑(EPDs)。與DLS測定的水動力直徑相比，HSFCM測量的光學(xué)直徑與EPDs較吻合。噬菌體λ的輕微偏差可能歸因于病毒通過偏振激光束傳遞時(shí)由其長剛性尾巴引起的定向效應(yīng)。從測量精度的角度來看，HSFCM的性能優(yōu)于DLS。例如，對噬菌體T7的測量粒徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3nm，而由DLS獲得的值的標(biāo)準(zhǔn)偏差大約高出10倍。這些結(jié)果表明，通過使用二氧化硅納米顆粒作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，HSFCM能夠精確地測量病毒大小，其分辨率與透射電鏡相當(dāng)。特別是，每分鐘10 000 個(gè)粒子，可以在2-3min中獲得可靠的尺寸分布曲線。 病毒產(chǎn)品的純度評估在許多生物技術(shù)應(yīng)用中是必不可少的。從圖4a中可以看出，許多粒子可以共存于被野生型噬菌體感染的宿主細(xì)胞的裂解液中，包括細(xì)胞碎片、DNAfree前端、空衣殼(DNA排出后)和成熟的病毒粒子。圖4bi和圖ii分別顯示了通過聚乙二醇沉淀得到的噬菌體T7粗提物和密度梯度離心后得到的純化產(chǎn)物的SS信號分布直方圖。對于粗提物，假設(shè)低散射強(qiáng)度的峰由細(xì)胞碎片、前端和空衣殼組成，而高散射強(qiáng)度的峰為成熟的病毒粒子。在我們的HSFCM設(shè)置中，流體動力學(xué)聚焦的樣品流(ca. 1.4um)在激光束的中心區(qū)域(16um)內(nèi)完全照明，可達(dá)到近100%的檢測效率。因此，可以使用單粒子計(jì)數(shù)來量化每個(gè)群體的豐度，檢測到成熟病毒粒子的比例從粗提物中的29.5%提高到純化后的93.6%。 將HSFCM方法進(jìn)一步應(yīng)用于監(jiān)測病毒基因組的釋放過程。圖4cii顯示，用1.0mNaClO4溶液處理20h后，除了成熟的病毒粒子外，還出現(xiàn)了一個(gè)散射強(qiáng)度較低的峰，可以認(rèn)為是噬菌體T7的空衣殼。當(dāng)使用1.5m的NaClO4溶液時(shí)，空衣殼的數(shù)量達(dá)到95%。這些結(jié)果證實(shí)，HSFCM僅僅通過檢測單個(gè)粒子的散射信號，就可以很容易地區(qū)分T7的空衣殼和成熟的T7病毒粒子。NaClO4濃度對T7衣殼產(chǎn)生的影響如圖4d所示。為了進(jìn)一步探究衣殼-基因組之間的相互作用，我們對DNA釋放的動態(tài)過程進(jìn)行了監(jiān)測(圖4e)。據(jù)報(bào)道，DNA從噬菌體排出體外是一個(gè)自發(fā)的過程，但動力學(xué)和熱力學(xué)都沒有完全了解。有趣的是，一旦NaClO4被添加(ca. 從樣本注射到分析的1min)，大約13%的病毒粒子完成了病毒基因組的釋放，15min后增加到21%。DNA釋放的作用速率在前5h增加，釋放后降低。20小時(shí)后，大約97%的病毒粒子已經(jīng)完成了其病毒基因組的釋放。值得注意的是，T7粗提物中前端的散射信號(圖4bi，峰值約為1100個(gè)顆粒)略高于成熟病毒粒子DNA釋放產(chǎn)生的空衣殼(圖4ciii，峰值約為600個(gè))。 總之，HSFCM方法為病毒的高分辨率和高通量表征提供了一種簡單而實(shí)用的方法。HSFCM的高靈敏度能夠檢測到直徑小于30nm的病毒，并有效區(qū)分混合物中不同類型的病毒，在病毒產(chǎn)品制造過程和存儲期間分析中可廣泛應(yīng)用。HSFCM在區(qū)分同一病毒顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異的能力，尤其是噬菌體PP01收縮或擴(kuò)展尾纖維，空衣殼從成熟T7噬菌體的完全分離，DNA包裝前和DNA釋放后（空衣殼）的區(qū)分，表明HSFCM方法可以是一種有效的病毒學(xué)研究方法。然而，值得注意的是，由于有大量散射物體的存在，如在血清或血漿中檢測到病毒的情況下，核酸需要熒光染色來區(qū)分單個(gè)病毒。因此，HSFCM裝置的熒光通道可以應(yīng)用于進(jìn)一步擴(kuò)展在許多現(xiàn)實(shí)條件下的病毒分析。 文章就分享到這里，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~ 參考文獻(xiàn)： [1]Ma, L; Zhu, S; Tian, Y; et al.Label-Free Analysis of Single Viruses with a Resolution Comparable to That of Electron Microscopy and the Throughput of Flow Cytometry.[J].Angew Chem Int Ed Engl.2016,55(35):10239-43 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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