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[求助]
請教2-oxoglutarate-dependent dioxygenases體外酶活檢測注意事項 已有2人參與
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| 最近在做一個2-oxoglutarate-dependent dioxygenases的體外酶活活性一直做不出來，于是找了一個文章報道的已知功能的酶去做體外酶活，蛋白純化沒問題，體外酶活條件也是按照文獻報道做的，可是也做不出來，求助大神這個反應(yīng)有沒有什么需要注意的細節(jié)沒。 |
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pennchem
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【答案】應(yīng)助回帖
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酶的活性及其檢測（一）-穩(wěn)態(tài)動力學(xué) 近代生命科學(xué)的研究的興起，和酶的研究的發(fā)展是同步的。生物，哪怕是最簡單的生物都含有眾多的高分子物質(zhì)如核酸，多糖，蛋白，脂類等等。如果沒有純度很高的酶，是無法展開更多研究的。沒有酶的作用理論突破，也是無法進行酶的定量研究。第一個發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶的Arthur Kornberg在核酸復(fù)制酶學(xué)十誡里面有兩條：（1）不要為不純的酶或（2）不純的底物而浪費精力[1]。 酶作用的基本要素包括純的酶，純的底物，將兩者混合后，可以觀察底物的消耗，或者看產(chǎn)物的生成，如果檢測手段足夠，可以看中間態(tài)的生成與消耗。下面一個曲線，在學(xué)習(xí)初期，讓我困惑了很久。 這張圖中，在前面10（分鐘）內(nèi)，產(chǎn)物的增加呈線性，10-25（分鐘）之間產(chǎn)物增加，但是增加速度變慢，在25分鐘后，產(chǎn)物不再增加。我在一些文獻中，會看到類似的圖出現(xiàn)。它反應(yīng)出的信息是產(chǎn)物增加，隨時間變化增加變緩最終達到平臺期。解釋起來的原因會有多種，（1）隨著底物消耗，酶沒有足夠的底物，最后酶催化反應(yīng)停滯，（2）酶不穩(wěn)定，在反應(yīng)過程中逐漸失活，（3）產(chǎn)物對酶有抑制作用，還有其它可能的解釋。 讓人困擾的是，有時候圖一和米氏曲線（圖二）太像了。下面的圖中，在一定底物濃度范圍內(nèi)[如10（微摩爾）]，反應(yīng)速率隨著底物濃度增加而線性增加。在10-25（微摩爾）之間，隨著底物濃度增加，速率增加趨緩。在25微摩爾之后，反應(yīng)速率不再隨著底物濃度增加而變化將實驗數(shù)據(jù)用方程 y=A×x÷(B+x) （其中A，B為常數(shù)，y為反應(yīng)速率，x是底物濃度） 來擬合，以下為底物的三種特例： （1）當?shù)孜餄舛群艿蜁r y=lim┬(x→0)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化為： y =(A/B)×x 此時反應(yīng)底物濃度低，反應(yīng)速率與底物濃度呈正比 （2）當?shù)孜餄舛茸銐蚋邥r y=lim┬(x→∞)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化為 y = A (A稱為Vmax) 此時反應(yīng)底物濃度高，反應(yīng)速率為常數(shù)，與底物濃度無關(guān) （3）當y = A/2 方程為 A/2=A×x÷(B+x) 得到 x = B （B稱為Km） 利用Igor Plot，擬合米氏方程給出的值是。注：后面給出的不是實驗誤差值，而是擬合誤差。 A =158.25 ± 8.79 （單位） B =10.015 ± 1.73 （單位） A的生化意義是在反應(yīng)體系中，一定酶濃度能達到的最大反應(yīng)速率，而B的含義則是酶達到最大反應(yīng)速率的一半時，對應(yīng)的底物濃度。 這就是生化課本中的米氏方程。在實驗中，底物濃度足夠高和足夠低是相對B而言，數(shù)學(xué)意義上的極高和極低在實驗中可操作性不強。 在一個酶催化反應(yīng)體系中，酶的濃度是固定的，酶與底物結(jié)合是酶催化底物的前提，如以下平衡： 酶+底物↔酶*底物復(fù)合物 而酶催反應(yīng)的發(fā)生最簡機理如下： 酶+底物↔酶*底物復(fù)合物→酶+產(chǎn)物 ① ② 在反應(yīng)步驟①及②中，在底物濃度較低情況下，①是限速反應(yīng)，根據(jù)質(zhì)量作用定律，在一定濃度范圍內(nèi)，酶*底物復(fù)合物的形成速率與底物的增加成正比，所以此階段，反應(yīng)速率和底物增加呈線性關(guān)系。而底物增加到一定濃度后，此時，幾乎所有的酶都以酶*底物復(fù)合物的形式存在，②變成了限速反應(yīng)，反應(yīng)速度和底物濃度沒有關(guān)系。在反應(yīng)①時，底物在溶液中移動速率時自由擴散，此步反應(yīng)為可逆，反應(yīng)②為不可逆反應(yīng)（或逆反應(yīng)速率很�。�。 我的老師曾說過做酶動力學(xué)實驗是生物實驗中最容易產(chǎn)生數(shù)據(jù)的，幾組實驗下來，總能找到數(shù)據(jù)來計算A（Vmax）和B（Km）。但我當初做酶活實驗時，發(fā)現(xiàn)幾個問題，（1）底物濃度低時實驗數(shù)據(jù)變動較大，（2）Vmax重復(fù)性較好，Km重復(fù)性較差。為了得到重復(fù)性好的，可靠性高的數(shù)據(jù)，個人經(jīng)驗如下： （1）選擇合理的反應(yīng)酶濃度，太高，測低底物濃度反應(yīng)速度數(shù)據(jù)波動大；太低，反應(yīng)很容易飽和，Km值偏差特別大 （2）合理篩選反應(yīng)底物濃度區(qū)間及離散距離，建議在Km值兩旁平衡分步，在左側(cè)間距相近，右側(cè)間距可以拉開 （3）控制反應(yīng)溫度，有條件的話，讓反應(yīng)溫度恒定，攪拌均勻，確信酶在反應(yīng)監(jiān)測時間內(nèi)穩(wěn)定 （4）如果不同時間內(nèi)的數(shù)據(jù)相互比較，用同一批次的酶（可低溫分裝），用同一批次的底物（最好標定底物濃度），同批配置的反應(yīng)buffer，同樣的反應(yīng)器皿（如石英杯），同樣的檢測器等。 先說一下這兩張圖的聯(lián)系，在圖一中，是底物濃度和時間的關(guān)系，所以曲線每個點的切線斜率就是反應(yīng)速度（濃度/時間）。以每個底物濃度，做一個底物濃度和時間的實驗，取其初期的直線部分，計算得到該底物濃度下的反應(yīng)速率，就得到下圖的一個點。對不同底物（如9個）濃度做圖一曲線，計算得到9個速率，然后作圖二，就完成了米氏實驗。根據(jù)實驗重復(fù)原則，一般每個點要重復(fù)3次，所以為了得到圖二，要做27個圖一的實驗（稱之為re-plot）。 酶和底物需要結(jié)合后才能進行催化反應(yīng)的概念首先被物理化學(xué)家Victor Henri在1901年研究糖水解酶時發(fā)現(xiàn)，他第一次給出了反應(yīng)速率與底物和產(chǎn)物濃度的方程式。Henri是酶動力學(xué)的先驅(qū)，米氏動力學(xué)也被稱為Henri-Michaelis-Menten kinetics。他的研究啟發(fā)了德國生物化學(xué)家Leonor Michaelis以及加拿大物理學(xué)家Maud Menten，他們給出了更簡潔的表達式，而且明確的提出了反應(yīng)機理。 值得注意的是，米氏方程應(yīng)用于描述的是平均化的結(jié)果，其中酶反應(yīng)過程的中間步驟的信息被平均掉了，如何得到反應(yīng)過程中的信息，下一篇將會闡述。 原創(chuàng),圖片無法貼上去，轉(zhuǎn)請@pennchem |
7樓2022-03-15 21:03:24
pennchem
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2樓2022-01-16 12:16:27
3樓2022-01-18 12:32:00
5樓2022-03-15 20:57:10
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