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z1358382木蟲 (正式寫手)
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[求助]
Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型構(gòu)建
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請問有沒有大佬利用transwell 小室和Caco-2 細(xì)胞構(gòu)建吸收轉(zhuǎn)運(yùn)模型，并成功過，我一直構(gòu)建失敗，尋求解答 1.培養(yǎng)耗材： ①我利用康寧3401和3417這些PC和PET膜來構(gòu)建，這些顯微鏡可視和不可視的都嘗試過， ②培養(yǎng)基：細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，日常培養(yǎng)基采用10%FBS，1%雙抗的MEM，（MEM本身含有100mg/L D-葡萄糖，2200mg/L NaHCO3,292 mg/L L-谷氨酰胺，Earle's平衡鹽以及NEAA）商家的細(xì)胞就是采用MEM培養(yǎng) 2.構(gòu)建 細(xì)胞生長到80%以上，進(jìn)行消化，先用500微升含EDTA的胰酶預(yù)消化10秒，吸掉，去除貼壁不牢以及細(xì)胞團(tuán)，再加胰酶消化三分鐘，然后就是正常傳代，電腦細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋 ①12孔板的小室（面積1.12cm2的），上室/下室體積添加為，500μL/1.5mL,文獻(xiàn)也是這樣的，我選擇了接種密度是12孔的2.5×10五次方個(gè)/mL，后面也試過1.2×10五次方個(gè)/mL，（2.5×10五次方個(gè)/mL和英文文獻(xiàn)的2×10五次方個(gè)/cm2進(jìn)行換算，細(xì)胞數(shù)目差不多，但是失敗了，所以后面選擇1.2×10五次方個(gè)/mL，還是失敗了）然后上室加500μL懸液，根據(jù)有個(gè)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建，我上午接種完，6小時(shí)左右后棄掉了培養(yǎng)基，更換新的培養(yǎng)基，文獻(xiàn)說這樣是避免長多層，因?yàn)槭菢?gòu)建單層細(xì)胞模型，然后就是隔天換液，到14天后，本應(yīng)該天天換液，但是細(xì)胞出現(xiàn)脫落，試驗(yàn)算是失敗，無法進(jìn)行，就沒有更換舍棄了 ②24孔板的（0.33cm2），上室/下室100μL/600μL，2×10五次方個(gè)/mL或者1×10五次方個(gè)/mL，接種上室100μL/200μL,兩種密度和加樣體積都進(jìn)行了嘗試，因?yàn)橛形墨I(xiàn)體積是200μL/600μL（細(xì)胞數(shù)目換算也和英文8×10四次方個(gè)/cm2差不多），也是如上6小時(shí)后換液去除沒有貼壁的細(xì)胞，然后后面都是隔天換液，這個(gè)也依然脫落 培養(yǎng)基使用的和日常培養(yǎng)的一樣，采用10%FBS，1%雙抗的MEM，（MEM本身含有100mg/L D-葡萄糖，2200mg/L NaHCO3,292 mg/L L-谷氨酰胺，Earle's平衡鹽以及NEAA） ③根據(jù)文獻(xiàn)，我后面更改了培養(yǎng)基將血清減半，前三天采用10%FBS進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目正常生長增殖，后面都是采用5%FBS，就是考慮到是不是營養(yǎng)太多以及細(xì)胞數(shù)目接種太多才脫落，才密度和血清都減半了 3.檢測TEER值，有時(shí)候上不去，也不知道為什么。還有就是有時(shí)候培養(yǎng)7-10天，電阻值就達(dá)到了300-400Ω，但是培養(yǎng)時(shí)間沒有標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)里的21天，不知道是否能進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 主要問題：1.構(gòu)建過程中培養(yǎng)基，要不要更換成分，我的培養(yǎng)基除了后面試驗(yàn)血清減半過，其他都如上所述，都是用的一樣的培養(yǎng)基 2.細(xì)胞密度也沒有問題。我正常前一周都貼壁生長，然后后面陸續(xù)開始脫落，不知道是培養(yǎng)基還是密度問題，細(xì)胞數(shù)目，血清濃度我都減半過 3.從細(xì)胞生長消化接種到后面的培養(yǎng)方法過程是否有問題 4.電阻值檢測：①電阻值上升緩慢的原因，②沒有達(dá)21天，已經(jīng)達(dá)到電阻值要求能否轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn) 想咨詢到底是哪里的問題，求解答 |
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