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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】熒光原位雜交fish
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原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交,從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。 原位雜交是在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,能過氫鍵結(jié)合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點(diǎn),應(yīng)用帶有標(biāo)記的(有放射性同位素,如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(RNA或DNA)片段進(jìn)行雜交,然后可用放射自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位;用原位雜交技術(shù),可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性,可進(jìn)一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。 以菌落原位雜交為例 對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落(100-200)進(jìn)行克隆篩選時(shí),可采用該方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后,對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 (1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 (2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。最后,在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒(如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。 (4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。 (6) 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。 實(shí)驗(yàn)條件: 切片機(jī)(石蠟和冰凍) |
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