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基于ERA技術(shù)的 CRISPR/Cas12a-assisted快速鑒定啤酒腐敗菌
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啤酒渾濁、風(fēng)味異變或酸敗主要是由于微生物中的腐敗菌、病菌搗亂的結(jié)果。一經(jīng)腐敗菌和病菌光顧，不消幾天甚至幾小時，就會變酸變質(zhì)，毒素 滋生 ，人們誤食了就會中毒生病，嚴(yán)重的還會危及生命。啤酒腐敗細(xì)菌檢測方法有多種，廣泛使用的傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法是耗時的，只允許回顧性監(jiān)測。免疫學(xué)的檢測方法適用于啤酒釀造過程的各個階段的樣品，其專一、簡便、易于自動化的特點預(yù)示其有較好的發(fā)展前景，但需要降低單克隆抗體的制備成本。經(jīng)典的檢測手段是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。然而RT-PCR需要使用昂貴的實時熒光定量PCR儀器，同時需要專業(yè)人士操作，尚不是一種現(xiàn)場檢測技術(shù)。而基于抗體的現(xiàn)場檢測手段，特異性和靈敏度一般不及核酸檢測方法，同時發(fā)展出高效價的抗體也需要數(shù)周乃至數(shù)月的時間，難以實現(xiàn)應(yīng)急檢測。 而在近日，國內(nèi)眾多研究所專家在歐洲食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合會（EFFoST）官方科學(xué)期刊刊登了快速鑒定啤酒腐敗細(xì)菌課題研究中取得突破性成果，通過由先達基因研發(fā)的酶促恒溫擴增技術(shù)（ERA技術(shù)），實現(xiàn)了對腐敗菌現(xiàn)場的準(zhǔn)確快速核酸檢測。 研究內(nèi)容 在本研究中，專家建立了一種快速、特異且高度便攜的基于 CRISPR/Cas12a 的關(guān)鍵啤酒腐敗細(xì)菌掃描方法，稱為 CRISPR-Beer Scan。以這些主要腐敗微生物物種的可變 16SrDNA片段為目標(biāo)，確定了高效和特異的crRNA。用ERA恒溫擴增方式，搭配合適探針，CRISPR-Beer Scan可以檢測低至10個拷貝的DNA目標(biāo)�？梢栽谄【浦姓{(diào)節(jié)的基因組DNA混合物中準(zhǔn)確識別痕量的目標(biāo)基因組DNA。此外，提取的基因組DNA樣本可以通過CRISPR-Beer掃描方法在45分鐘內(nèi)通過藍(lán)光激發(fā)的視覺熒光信號方便地進行區(qū)分。 研究特色 1、對crRNA靶標(biāo)的16SrRNA區(qū)域的確定。使用在線工具對該區(qū)域的序列及其側(cè)翼序列進行了設(shè)計，進一步選擇每個物種的3個crRNA，以靶向具有高度種內(nèi)保守和種間/種間變異的序列。 2、所設(shè)計的crRNA的有效性和特異性檢測。制備了重組的Cas12a蛋白和不同的crRNA，針對每種細(xì)菌的兩種crRNA通過了最初的測試。為了提高檢測靈敏度，這兩種物種特異性的crRNA隨后被組合在每個cas12a依賴的檢測反應(yīng)中。 3、等溫ERA與CRISPR/Cas12a相結(jié)合，可以敏感地檢測到微量的 DNA。足夠數(shù)量的底物DNA是CRISPR/Cas12a檢測系統(tǒng)可測量讀出的關(guān)鍵。因此，一個高效的目標(biāo)序列預(yù)擴增步驟可以顯著提高整體檢測靈敏度。酶促恒溫擴增技術(shù)(ERA)是一種等溫擴增方法，具有高靈敏度、快速動力學(xué)和對復(fù)雜反應(yīng)環(huán)境的良好耐受性。它已被廣泛用于細(xì)菌、病原體和病毒的檢測。為了確保目標(biāo)的充分預(yù)擴增，為每個目標(biāo)物種設(shè)計了兩個正向和兩個反向引物。將這些正向和反向引物分別組合成4對不同的引物，在ERA反應(yīng)中預(yù)擴增目標(biāo)。然后通過相應(yīng)的CRISPR/Cas12a檢測，確定最有利的擴增引物對。 4、CRISPR/Cas12a輔助檢測系統(tǒng)從啤酒腐敗細(xì)菌中鑒定出基因組DNA。為了測試更復(fù)雜的樣本，混合了不同的細(xì)菌基因組DNA組合。數(shù)據(jù)表明，即使與其他物種的DNA混合，也可以特異性識別啤酒腐敗細(xì)菌的DNA。 5、通過熒光，可以識別出CRISPR/cas12a輔助細(xì)菌檢測的熒光讀數(shù)。報告基因中485nm藍(lán)光激發(fā)的FAM組發(fā)出可見的、明亮的綠色光，用細(xì)菌DNA測試了這種方法。結(jié)果表明，這種方法將更兼容現(xiàn)場檢測。 6、實現(xiàn)了現(xiàn)場乃至居家檢測，通過簡單的藍(lán)白光成像儀乃至藍(lán)光手電筒可以通過熒光進行便捷檢測。 原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ifset.2021.102854 |
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