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pkD46敲除Red重組，出來的單菌落雜合，pCR結(jié)果顯示既有敲除打靶片段又有原片段 已有1人參與
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pkD46敲除Red重組，出來的單菌落雜合，pCR結(jié)果顯示既有敲除打靶片段又有原片段 打靶片段是PCR產(chǎn)物，上同源臂200bp+下同源臂200bp+SacB Kana gene+下同源臂200bp （下同源臂出現(xiàn)兩次是為了，第一次kana抗性篩選后，第二次蔗糖致死篩選，兩個下同源臂之間發(fā)生二次重組） pKD46轉(zhuǎn)入MG1655，挑單菌落30℃過夜培養(yǎng)，以1%接種量轉(zhuǎn)接，30℃培養(yǎng)至OD=0.25，加30mM L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)至OD=0.5，冰浴30min，10%甘油洗三次，50ml菌液濃縮至100ul3-4支 打靶片段PCR純化，DpnI消化，膠回收，濃度100-200ng/ul 4-5ul打靶片段電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，1mlLB重懸，30℃復(fù)蘇2h，離心濃縮至200ul，涂布Amp+kana板，30℃，長出幾十個菌落，但是菌落PCR發(fā)現(xiàn)，原有要敲得基因在，敲上去的打靶片段也在，而且送去測序了，測序證明都在，而且位置都對 也試過37℃復(fù)蘇培養(yǎng)的，存在同樣的問題 考慮是雜合，染菌，劃線，傳代培養(yǎng)，問題還是在 麻煩大家?guī)兔ο胂胗惺裁春玫慕鉀Q辦法？ 敲除驗證引物，在待敲基因上游基因組300bp處，打靶片段SacB基因上，待敲基因下游基因組300bp處，菌落PCR結(jié)果都是對的,而且送去測序都是對的 麻煩大家多多幫忙啊~@biostar2009 |
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2樓2022-04-21 15:51:00
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