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北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
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微生物內(nèi)進行蛋白質(zhì)表達前需要考慮的8件事 已有2人參與
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在微生物內(nèi)進行蛋白質(zhì)表達是生物科技中的核心技術(shù)。然而，每種蛋白質(zhì)都具有其獨特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，比如二硫鍵（disulfide bonds）數(shù)量，是否存在疏水區(qū)域 (hydrophobic regions)，是否存在跨膜區(qū)域 (transmembrane domains)，是否具有糖基化 (glycosylations) 等翻譯后修飾過程等， 所有的這些性質(zhì)都可能決定著蛋白質(zhì)表達過程的難易。在與目的蛋白質(zhì)來源相似的宿主內(nèi)表達蛋白質(zhì)要相對容易些。然而，大多時候，我們需要在與蛋白質(zhì)來源不同的宿主內(nèi)進行蛋白質(zhì)的表達，比如在原核細胞內(nèi)表達真核生物的蛋白質(zhì)，這通常是具有挑戰(zhàn)性的。在這里，小編與大家分享幾個有助于跨系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的工具。 1. 密碼子優(yōu)化 為了理解密碼子優(yōu)化(codon optimization)的重要性，我們需要首先知道什么是密碼子優(yōu)化。簡單來講，就是在我們構(gòu)建的載體內(nèi)引入宿主系統(tǒng)tRNA更愿意讀取的密碼子，這樣能夠更容易將其翻譯成氨基酸，這會提高翻譯速度，提高蛋白質(zhì)表達的效率。沒錯，我這里用了“更愿意”這樣一個主觀性很強的詞。實際中確實是這樣的，生物系統(tǒng)是具有密碼子偏好性的，不論真核生物還是原核生物，每種生物都會表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異和偏愛。這是因為不同生物系統(tǒng)對于特定的密碼子具有不同數(shù)量的可利用的tRNAs，并且每一個系統(tǒng)內(nèi)對于每一個密碼子，都有特定數(shù)量的tRNAs。所以，如果tRNAs與密碼子數(shù)量的比例不正確，就會阻礙蛋白質(zhì)的表達。因此，在進行蛋白質(zhì)表達前，需要根據(jù)表達系統(tǒng)，對目的基因進行密碼子優(yōu)化，使用宿主系統(tǒng)內(nèi)存在的tRNAs更偏好的密碼子。 2. 純化標簽 當(dāng)我們在微生物內(nèi)進行蛋白質(zhì)的表達時，最后通常都是要對蛋白質(zhì)進行純化的。當(dāng)然，如果你只是為了應(yīng)用全細胞提取物或者裂解提取物，可以不用考慮蛋白質(zhì)的純化問題。為了實現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化，我們必須為蛋白質(zhì)加上純化標簽。目前很多純化標簽已經(jīng)被系統(tǒng)研究并應(yīng)用于實踐了，常用的純化標簽包括His tag， Strep-II tag， GST， Flat-Tag等。有關(guān)蛋白質(zhì)的純化標簽，大家可以點擊鏈接，查看BioEngX歷史文章。 3. 分子伴侶與折疊酶 表達一個困難的基因就像砸碎一個硬堅果，有時候你需要借助外力。為了獲得一個有用的蛋白，很重要的一點就是保證蛋白質(zhì)正確折疊。細胞質(zhì)（cytoplasm）的環(huán)境還原性(reducing)的，這不利于二硫鍵的正確形成，因此會影響蛋白質(zhì)的折疊。為了輔助蛋白質(zhì)正確的折疊，防止形成不可溶的包涵體，我們需要表達分子伴侶(chaperones)和折疊酶(foldases)的輔助載體。一些常見的分子伴侶和折疊酶包括DsbA/C, Skp, FkpA, GroEL/ES, DnaK/J/GrpE等。我們可以根據(jù)蛋白質(zhì)的表達位置，選擇細胞質(zhì)（cytoplasmic）內(nèi)分子伴侶或者細胞間質(zhì)（periplasmic）分子伴侶。另外一些標簽也能夠輔助蛋白質(zhì)的折疊，比如麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein, MBP）。MBP是一個42.5 KDa的蛋白質(zhì)，能夠與目的蛋白質(zhì)融合表達，不僅能夠增加蛋白質(zhì)的可溶性，還能夠輔助蛋白質(zhì)折疊。MBP的另一個優(yōu)勢是能夠與交聯(lián)淀粉柱（amylose column）結(jié)合實現(xiàn)目標蛋白的純化。 4. 蛋白質(zhì)表達位置 在實驗之前，我們需要考慮蛋白質(zhì)在哪里表達，是細胞質(zhì)內(nèi)（cytoplasm），細胞間質(zhì)（periplasm）還是細胞外(extracellular)分泌表達。如果一個蛋白質(zhì)內(nèi)包含有二硫鍵，我們最好在細胞間質(zhì)的氧化環(huán)境內(nèi)令其表達。氧化環(huán)境能夠幫助蛋白質(zhì)形成正確的二硫鍵從而獲得正確的結(jié)構(gòu)。如果想要蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)特定的位置表達或分泌到細胞外，需在蛋白質(zhì)的N端添加信號肽（signal sequence）。在信號肽的幫助下，蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)移到特定的位置。例如，來自果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）內(nèi)的PelB信號肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)進入到革蘭氏陰性菌（gram-negative）的細胞間質(zhì)中。再比如，來自變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）內(nèi)的信號肽能夠?qū)⑹沟鞍踪|(zhì)分泌表達到培養(yǎng)基之中。 5. 蛋白質(zhì)表達通路 蛋白質(zhì)分泌表達具有很多的優(yōu)勢。一方面分泌表達蛋白質(zhì)能夠減少對宿主菌的毒性和代謝負擔(dān)，使菌適應(yīng)性增加；另一方面周質(zhì)空間和胞外培養(yǎng)基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的純化。不同的表達途徑對蛋白質(zhì)的折疊效率有很大的影響。革蘭氏陰性菌共分為5種天然分泌系統(tǒng)，即I型，II型，III型，IV型和V型。 E.coli 主要通過I型和II型系統(tǒng)分泌表達蛋白質(zhì)。Ⅰ型分泌系統(tǒng)通過α-溶血素途徑直接介導(dǎo)胞外分泌，組成元件簡單，外源重組蛋白與HlyAC-端結(jié)合后，再與HlyB/HlyD形成復(fù)合物，由ATP水解提供能量，通過TolC通路實現(xiàn)胞外分泌。通過該系統(tǒng)分泌出胞外的蛋白C端仍然帶有一段信號序列，需要在體外進行剪切;此外該系統(tǒng)中的一些共表達部件對目的蛋白的轉(zhuǎn)運有競爭作用，重組蛋白表達量很低。Ⅱ型分泌系統(tǒng)先介導(dǎo)細胞周質(zhì)分泌，再經(jīng)過MTB(main terminal branch)機制實現(xiàn)胞外分泌。分泌蛋白利用以下三種途徑透過細胞質(zhì)膜: Sec (secretion)通路、信號識別顆粒(signal recognition particle, SRP)通路或雙精氨酸轉(zhuǎn)移(twin arginine translocation, TAT)通路。三種通路有所不同，Sec通路將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間后蛋白質(zhì)進行折疊，TAT通路卻是將折疊后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞周質(zhì)，而SRP途徑允許蛋白質(zhì)同時進行折疊與轉(zhuǎn)移的過程[1]。由于Ecoli跨越內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運裝置不完善，蛋白輸出能力不夠,蛋白酶降解等原因?qū)е路置谛实�，胞外分泌量往往達不到實驗或工業(yè)生產(chǎn)的要求，目前大腸桿菌的分泌主要是指重組蛋白通過Ⅰ或Ⅱ型系統(tǒng)透過胞質(zhì)膜分泌至周質(zhì)腔[2]。 6. 表達菌株 不同的大腸桿菌菌株在培養(yǎng)條件和外源基因表達能力上存在著很大差別，因此不同宿主菌的選擇對表達產(chǎn)物的積累以及下游分離純化有至關(guān)重要的作用。利用蛋白酶表達缺陷的突變菌株可以提高重組蛋白的分泌表達量,一些缺陷性菌株(如合成外膜元件的基因突變體)既能夠產(chǎn)生可溶性的、具有正確空間結(jié)構(gòu)和二硫鍵的活性蛋白，又能夠避免細胞壁在外源蛋白跨膜轉(zhuǎn)運中的阻礙作用，有利于重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。最成功的例子就是L2型細菌(缺乏細胞壁和胞周質(zhì))已用于青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶、鏈激酶、微小抗體的分泌表達中。但因為這些菌株有生長受損性，不能耐受高密度發(fā)酵的過程，L2型細菌不適合工業(yè)化生產(chǎn)�？傊泻芏喾N類的菌株可以用來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達。有關(guān)大腸桿菌的菌株及表達載體，大家可以從這個網(wǎng)站了解到，www.abiocenter.com。 7. 培養(yǎng)基，溫度，誘導(dǎo)條件等因素 培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)過程中抑制性代謝產(chǎn)物的積累等都會影響重組蛋白在工程菌中的表達產(chǎn)量和分泌的量。其中培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、pH和溫度等參數(shù)是影響工程菌生長和表達外源蛋白的重要因素,能夠影響蛋白酶的活性、分泌和表達水平。向培養(yǎng)基中添加甘氨酸可以在不導(dǎo)致菌體自溶的情況下促進蛋白從周質(zhì)空間向胞外的分泌,且不引起明顯的細菌裂解。在培養(yǎng)基中添加糖膠和TritonX-100能阻止周間腔中包涵體的形成，并提高胞外表達的效率。改變培養(yǎng)基的滲透壓、短時間的熱沖擊誘導(dǎo)及降低誘導(dǎo)時的溫度,會明顯提高重組蛋白在大腸桿菌的可溶性表達。另外，對于需要IPTG誘導(dǎo)的菌株，誘導(dǎo)時刻，溫度及培養(yǎng)時間必須經(jīng)過優(yōu)化。 8. 細胞培養(yǎng)時間 合適的細胞培養(yǎng)時間是決定著細胞完整度及蛋白質(zhì)表達水平的一個重要因素。細胞培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細胞裂解，目的蛋白丟失，有毒蛋白酶釋放。而細胞培養(yǎng)時間太短的直接后果就是細胞濃度不夠，目標蛋白產(chǎn)率太低。因此重組菌株的培養(yǎng)時間必須經(jīng)過優(yōu)化。 |
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我們也遇到過：改變細菌培養(yǎng)基成份，讓滲透壓升高，導(dǎo)致細菌菌體體積變大，約為是平常的2-3倍。不過我們的關(guān)注點是細菌的活性和生物量，以及它對污染物的降解效果！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2021-10-17 17:45:23
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3樓2022-07-11 09:44:49
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