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小強(qiáng)2133新蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒提取問題 已有1人參與
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連載體，陽性驗(yàn)證，質(zhì)粒不是環(huán)狀嗎？咋提出來是這種？求大佬幫忙分析下！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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如果你是提取的質(zhì)粒直接進(jìn)行電泳，這樣的電泳圖是正常的，質(zhì)粒本身是環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，但在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)或者不同的生命周期里，常常存在質(zhì)粒超螺旋的結(jié)構(gòu)（比如在圓環(huán)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)螺旋呈麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)），而我們目前抽提質(zhì)粒的方法，沒辦法保證質(zhì)粒維持在一種結(jié)構(gòu)，無論是物理剪切力還是試劑原因，都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒開環(huán)甚至成為線性的DNA。 換句話講，你抽提質(zhì)粒后，其實(shí)里面有可能會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒的兩種到三種結(jié)構(gòu)：超螺旋結(jié)構(gòu)，開環(huán)結(jié)構(gòu)，線性結(jié)構(gòu)。而這三種不同的結(jié)構(gòu)在進(jìn)行瓊脂糖電泳的時(shí)候，遷移速度是不一樣的，導(dǎo)致一個(gè)質(zhì)粒的膠圖會(huì)出現(xiàn)兩條帶甚至三條帶（遷移速度通常是：超螺旋>線性>開環(huán)）。 樓主電泳目的是為了檢測克隆陽性，那么簡單的跑質(zhì)粒是沒有意義的（當(dāng)然可以起到檢測抽提質(zhì)粒濃度的作用），重組載體真實(shí)大小的通常是看線性質(zhì)粒的位置大�。ㄩ_環(huán)或者超螺旋結(jié)構(gòu)因?yàn)榇嬖趶?fù)雜的二級(jí)或者三級(jí)結(jié)構(gòu)，其電泳遷移速度不僅僅是和片段大小相關(guān)，故不能真實(shí)反映片段長短），所以你如果需要通過提質(zhì)粒篩選陽性克隆的話，是應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切或者雙酶切后，再進(jìn)行電泳檢測，這時(shí)候的結(jié)果才對篩選克隆有參考價(jià)值，祝好！ |
2樓2021-06-11 09:04:25
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