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黎明之前01新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
載體測(cè)序無(wú)信號(hào)是怎么回事？ 已有1人參與
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我之前用Infusion的方法連接不上，總是連上了兩端，中間缺失。然后我就換用T4連接的方法，先連接在T載體上，然后進(jìn)行菌液PCR，條帶正確，提了質(zhì)粒，雙酶切，膠回收后用于T4連接到我的骨架載體上，再進(jìn)行菌液PCR，條帶正確，送菌液測(cè)序無(wú)信號(hào)，然后自己提了質(zhì)粒去測(cè)序也無(wú)信號(hào)，這是什么原因呢？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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原海亮
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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- 專(zhuān)業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1、樓主首先要確認(rèn)挑選的克隆是正確的克隆，菌液pcr驗(yàn)證正確，應(yīng)該提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證是否真的為陽(yáng)性克隆。 2、菌液和質(zhì)粒均沒(méi)有信號(hào)，是不是載體拷貝數(shù)較低，樓主提取質(zhì)粒后有沒(méi)有進(jìn)行電泳檢測(cè)，確認(rèn)載體濃度高低。 3、測(cè)序沒(méi)有信號(hào)，和測(cè)序?yàn)榭蛰d還是兩個(gè)不同的問(wèn)題，一方面與載體濃度有關(guān)，另一方面樓主要確認(rèn)選擇的測(cè)序引物是否合適。 4、有可能測(cè)序供公司問(wèn)題。 解決辦法： 1、因?yàn)椴磺宄䴓侵魇褂玫目蚣茌d體是什么載體，是否有通用引物？ 其實(shí)樓主可以在構(gòu)建好T克隆后就進(jìn)行測(cè)序（T載體本身就經(jīng)常被用來(lái)做亞克隆測(cè)序），T載體有自己的通用引物，發(fā)生沒(méi)信號(hào)的概率比較低。因?yàn)槟愫罄m(xù)是進(jìn)行酶切亞克隆的，不存在PCR的過(guò)程（PCR過(guò)程可能導(dǎo)致錯(cuò)配或突變等情況，所以一般要測(cè)序驗(yàn)證），發(fā)生目標(biāo)基因突變的可能性較低，即T載體克隆階段測(cè)序結(jié)果可以作為你亞克隆后的測(cè)序結(jié)果（結(jié)合雙酶切驗(yàn)證結(jié)果）。 2、樓主也可以提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切確定為正確的質(zhì)粒，且質(zhì)粒濃度OK，可將該質(zhì)粒作為樣品送測(cè)序。 同時(shí)如果確認(rèn)之前選擇的引物沒(méi)有問(wèn)題，那么本次可以嘗試寄送 自己的引物作為測(cè)序引物，比如你菌落PCR用的引物就可以作為測(cè)序用。 3、如果上述方法沒(méi)辦法解決，可以用你的引物對(duì)挑選的克隆進(jìn)行pcr，然后膠回收你的目的條帶，將這個(gè)回收PCR產(chǎn)物和你自己的引物一同送去測(cè)序。 方法還是比困難多，祝好1 |
2樓2021-06-01 17:25:52
黎明之前01
新蟲(chóng) (初入文壇)
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感謝回復(fù)，受益良多 我已進(jìn)行過(guò)雙酶切驗(yàn)證，是正確的 載體濃度比較低 t載體質(zhì)粒小提濃度大概60ng T4連接以后小提濃度大概120ng 由于T載體濃度比較低，不好測(cè)序，我打算用你說(shuō)的最后一種方法看看，感謝！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2021-06-01 18:10:49
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