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NanoFCMlxq

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外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（五）: 領取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Journal of Translational Medicine（2020年IF=4.124）上的文章，名為《Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma》[1]（通過尺寸排阻色譜分離的細胞外囊泡適用于血漿中的RNA組學分析）。

近年來，越來越多的研究報道，豐富的循環(huán)RNA可作為預后的標志。例如，血清需高溫蛋白A2 (HtrA2)被報道與乳腺癌的進展有關，特別是與CA15-3和CEA聯(lián)合可提高診斷效率。此外，血清HOX轉錄反義RNA (HOTAIR)和miR-146的表達對慢性髓系白血病的伊馬替尼治療具有診斷價值或可作為靈敏的標記物。然而，血清中存在的RNA是不穩(wěn)定的，這限制了RNA的臨床應用。在這種情況下，細胞外囊泡(EVs)中的RNA和RNA組學為疾病診斷提供了一個潛在的生物標志物，因為EVs可以保護RNA免于降解。細胞外囊泡(EVs)的直徑范圍為40 ~ 1000 nm，是由蛋白質標記物(如：TSG101、ALIX、CD63等)和多種生物分子，如蛋白質、核酸、聚糖，以及其他信號分子。EVs可在幾乎所有體液中觀察到，并可被大多數(shù)細胞釋放，發(fā)揮各種功能。EVs在特定細胞間運輸生物分子的能力賦予其作為靶向藥物遞送載體和診斷標記物的應用潛力。

由于許多研究報道EVs可能與疾病進展密切相關，并提出其作為各種疾病的新型生物標志物的作用，應盡快開發(fā)EVs純化的最佳策略。雖然有幾種方法可以純化EVs，包括超離心、過濾、沉淀、層析、免疫親和捕獲，以及應用上述技術的商品化試劑盒。然而，很少有證據(jù)表明，通過上述方法分離的EVs能夠提供下游功能研究。目前，所有的技術都提供了不同等級的EVs的回收率和純度。一般來說，無法從EVs中分離出的雜質具有與其相似的尺寸或密度，因此不能以單一方式分離。這些技術的組合可以提高分離EVs的純度，但代價是明顯降低回收率。隨著醫(yī)學和生物學的發(fā)展，生物樣品的多樣性和下游分析的復雜性也對EVs的純化提出了更高的要求。

根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(https://www.exocarta.org)，多達3000個mRNAs和2800個miRNAs已在EVs中被鑒定。此外，越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs可以通過EVs進行分類，并影響腫瘤發(fā)生、腦功能障礙等疾病。RNA測序是液體活檢中最廣泛使用的基于EVs的生物標志物開發(fā)技術，大量體液源EVs中的RNA已被報道為潛在的診斷標志物。一般情況下，不同EVs分離方法獲得的RNA在效率、RNA分布特征、覆蓋程度等方面可能存在差異，導致分析結果的重復性較差。因此，在確定研究方案之前，需要綜合比較現(xiàn)有的EVs中RNA測序提取方法的性能。

本研究中比較了4種最終用于RNA組學分析的EVs分離方法的性能，包括UC、SEC、ExoQuick和exoEasy kit。據(jù)我們所知，本研究首次全面比較了目前最常用的四種EVs分離方法的RNA組學性能。本研究可能為理解EVs分離方法提供更多的見解，并為進一步研究基于EVs的組學分析奠定基礎。

研究過程：

一、準備血漿

采集同一供體4 mL新鮮血漿(采集后30 min內完成預處理，立即進行EVs分離，不需冷凍)，平均分成4等份，每等份采用一種特定的提取方法。來自同一供體的樣品，在一致的預處理條件下，將使實驗過程中的個體因素影響最小化。EVs的分離是在沒有冷凍的情況下進行的，以便將冷凍對樣品質量的影響降到最低。全血標本在室溫下暫時保存于EDTA采集管中(不超過30分鐘)。在處理前，必須確保沒有觀察到可見溶血。室溫下1600 g離心15分鐘，使細胞沉降。將上清轉移到新的EP管中，10000g離心30分鐘，在室溫下清除碎片和大囊泡。使用前應準備好血漿樣品。

二、EVs分離

本研究比較了4種EVs分離方法：超離心(UC)、exoEasy kit (QIAGEN)、排阻層析(qEV [Izon]、Exosupur [echobiotech])、ExoQuick kit (Thermo Fisher)。

UC分離EVs：血漿樣品2000 g離心10 min，上清用0.22?m(Corning)過濾系統(tǒng)過濾。然后100000 g 4°C離心2 h(SW 55 Ti轉子，Beckman Coulter)，然后用PBS洗，100000 g 4°C離心2 h。沉淀用1×PBS重懸。
exoEasy分離EVs：預過濾血漿在4°C下3000g離心15分鐘。在1體積的樣品中加入1份XBP緩沖液。將試管輕輕翻轉5次，混勻溶液，并將混合物置于室溫。將混合物加到exoEasy柱，500 g離心1分鐘。丟棄流出的溶液，將柱子置于同一收集管中，加入3.5 mL XWP緩沖液，5000 g離心5 min，去除柱中的殘余液體。棄去所有流出的液體。將柱子移至新的收集管，吸附在柱上的EVs可以用XE緩沖液洗脫，用于BCA、NTA和TEM分析，或用QIAzol試劑進行RNA分離。
SEC分離EVs：SEC按說明書(QEV (Izon)，Exosupur (echobiotech))進行。簡單地說，先將血漿樣品2000 g離心10 min，離心后用0.22?m過濾系統(tǒng)過濾上清。然后，將血漿添加到柱的頂部。用1×PBS收集含有EVs的部分。收集的組分用100 K Amicon Ultra-15離心過濾裝置(EMD Millipore)超濾濃縮。
ExoQuick分離EVs：將血漿樣品3000g離心15 min，上清轉移至無菌管中。加入ExoQuick試劑，將離心管倒置數(shù)次，充分混合溶液。4℃靜置，1500g離心30 min，吸出上清，1500 g離心5 min，吸上清。加入1×PBS重懸沉淀。
三、納米流式檢測（NanoFCM）

在測試前分別用濃度標準品和粒徑標準品進行參數(shù)校準。采用納米流式檢測儀收集1分鐘。根據(jù)標準品測定樣品的顆粒濃度和顆粒直徑。

四、透射電鏡（TEM）

新鮮分離的EVs懸液用4%多聚甲醛固定1h。從不同樣品分離的EVs懸液(各約5μL)加到銅網形式涂層碳穩(wěn)定網，讓銅網吸收4 - 5分鐘，然后用濾紙擦除。EVs負染時，1%醋酸鈾酰水溶液(5 μL)置于銅網上30 s，然后用Whatman濾紙擦除。徹底干再進行觀察。

五、Western blot分析

在提取的EVs樣品中加入200 μL帶有蛋白酶抑制劑的冰凍NP-40緩沖液，懸浮于合適的緩沖液中，制備蛋白樣品。每10分鐘混合搖勻一次，然后在冰中孵育50分鐘。蛋白質濃度通過BCA (Applygen)檢測。然后加入2 ×上樣緩沖液(200 μL)，攪拌均勻，加熱至沸騰。蛋白質樣品(50 μg)用8-10% SDS凝膠分離，在PVDF膜上進行免疫印跡。然后用BSA阻斷1 h，一抗(APOB、AGO2、HSA、Alix、Tsg101、CD9或CD63)在4℃孵育過夜。然后用含0.1% Tween的Tris緩沖鹽水洗滌膜，與二抗室溫孵育1 h。然后，再次清洗薄膜，并暴露于ECL(電化學發(fā)光)。

六、ExoRNA分離和RNA分析

使用miRNeasy Mini試劑盒(Qiagen)根據(jù)說明書操作。在1.5%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA降解和污染，特別是DNA污染。使用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)和安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies)評估RNA濃度和純度。所有RNA測序均使用單一樣本進行。

七、文庫制備和測序

用Ovation?SoLo RNA- seq Library Preparation Kit (NuGEN)將每個樣本共5ng RNA作為測序庫的input，并將 index codes添加到每個樣本的屬性序列中。對于小RNA庫，每個樣本取2.5 ng RNA作為RNA樣品制備的input。使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB)生成測序庫，并將index codes添加到每個樣本的屬性序列中。最后，利用AMPure XP系統(tǒng)對PCR產物進行純化，并用Agilent Bioanalyzer 2100和qPCR對文庫質量進行評價。在acBot聚類生成系統(tǒng)上使用TruSeq PE Cluster Kitv3-cBot-HS (Illumia)，對樣本進行聚類。聚類生成后，利用Illumina Hiseq平臺對文庫準備進行測序，生成雙端reads。

八、數(shù)據(jù)分析

變量平均值的比較采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以mean ± SEM表示。GraphPad Prism用于統(tǒng)計分析和圖形生成(GraphPad Software)。在使用Shapiro-Wilk和Levene檢驗正態(tài)性和相同的方差后，使用Kruskal-Wallis檢驗分析異常平均值之間的差異。P值< 0.05為有統(tǒng)計學意義。

結果展示：

附圖。

結果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Yang, Y; Wang, Y; Wei, S; et al.Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma.[J].J Transl Med.2021,19(1):104

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銀蟲 (著名寫手)

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