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wilsonismal新蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒構(gòu)建過程中，載體上基因大量丟失
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各位大佬們，我想將潮霉素抗性基因（1400 bp）連接到一個(gè)具有氨芐抗性的載體上（6000 bp） 我是先將載體通過XbaI-HindIII雙酶切，切除一個(gè)900 bp左右的片段，進(jìn)行線性化，并通過膠回收進(jìn)行回收，回收的線性化載體（5000 bp），測序后結(jié)果符合預(yù)期 潮霉素基因通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過消化和PCR回收進(jìn)行純化，測序后結(jié)果也符合預(yù)期 潮霉素基因和線性化的片段分別使用T4 和同源重組進(jìn)行連接，并分別轉(zhuǎn)化入BL21，Trans10和JM109感受態(tài)，并使用有潮霉素和氨芐的抗性平板進(jìn)行篩選 12小時(shí)后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR（引物位置在潮霉素基因上），結(jié)果呈陽性 挑取陽性菌在含有潮霉素和氨芐的液體LB培養(yǎng)基后培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行sanger測序（測序引物在潮霉素基因兩端載體上），結(jié)果測序失敗，然后使用氨芐通用引物對質(zhì)粒進(jìn)行測通，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒長度僅有3900 bp，與預(yù)期中連接后6500 bp不符，經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒中僅保留了質(zhì)粒的Ori，氨芐抗性（AmpR）和潮霉素抗性（Hygr）區(qū)域，其他地方都沒了 請問有人遇見過這種問題嗎，怎么解決啊 |
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為什么要用這幾個(gè)菌做克隆？這幾個(gè)菌貌似都不是核酸酶或重組酶缺陷的？質(zhì)粒在其中本來就不穩(wěn)定。你要用DH5a或top10 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2021-04-18 14:30:08
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