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xbwwsq

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[交流] qPCR檢測(cè)限為什么不是拷貝數(shù)/反應(yīng)，而是拷貝數(shù)/mL

目前看到的關(guān)于新冠等核酸檢測(cè)試劑盒標(biāo)明的檢測(cè)限都是“拷貝數(shù)/mL”，這是怎么測(cè)出來(lái)的，看了很多文章都說(shuō)是利用已知濃度的病毒顆�；蛸|(zhì)粒十倍稀釋后看最低能檢測(cè)到的拷貝數(shù)，并沒(méi)有寫(xiě)明詳細(xì)做法。不理解的是，為什么檢測(cè)限不以“拷貝數(shù)/反應(yīng)”來(lái)表示，比如1000拷貝/mL的樣品1mL，模板加10μL和1μL肯定是不一樣的，所以這個(gè)1000拷貝/mL表示一個(gè)反應(yīng)能檢測(cè)到多少呢。如果我們自己設(shè)計(jì)qPCR反應(yīng)，檢測(cè)限應(yīng)該達(dá)到多少個(gè)拷貝/反應(yīng)才是合適的呢，自己做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候500個(gè)拷貝/反應(yīng)的ct值就已經(jīng)36了，是哪里的問(wèn)題呢

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1樓 2021-04-12 14:26:38

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山舞銀蛇

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xbwwsq(金幣+1): 謝謝參與

cp/ml是以初始樣本計(jì)算的，做得好的，可以做到100cp/ml。
然后取200μl樣本，也就是取到了20個(gè)cp，經(jīng)過(guò)核酸提取，回收率一般30~70%，還剩6~14 cp。
洗脫體積50，算上蒸發(fā)，剩余30μl 核酸，如果上樣20μl，就是4~9 cp。
那么對(duì)應(yīng)PCR部分不計(jì)算提取的檢出限就是4~9 cp/PCR

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6樓2021-04-25 14:49:10

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xbwwsq

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6樓: Originally posted by 山舞銀蛇 at 2021-04-25 14:49:10
cp/ml是以初始樣本計(jì)算的，做得好的，可以做到100cp/ml。
然后取200μl樣本，也就是取到了20個(gè)cp，經(jīng)過(guò)核酸提取，回收率一般30~70%，還剩6~14 cp。
洗脫體積50，算上蒸發(fā)，剩余30μl 核酸，如果上樣20μl，就是4~ ...

老師您好，謝謝您的回答，很好奇qPCR真能做到10 copy/反應(yīng)啊，我平時(shí)做實(shí)驗(yàn)挺粗放，沒(méi)有做過(guò)這么細(xì)。我現(xiàn)在做到500copy/反應(yīng)的Ct值就已經(jīng)34、35了，請(qǐng)問(wèn)這個(gè)原因是什么呢，是因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)的不夠好嗎。我的擴(kuò)增效率用sybrgreen染料法測(cè)，計(jì)算下來(lái)是90%，應(yīng)該也還行啊。期待您的回復(fù)

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8樓2021-05-19 23:47:33

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山舞銀蛇

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9樓: Originally posted by xbwwsq at 2021-05-19 23:52:50
另外，如果這1ml（100cp/ml）的樣本全部提取，然后用50ul洗脫，假設(shè)蒸發(fā)后剩30，上樣20ul的話，這樣計(jì)算下來(lái)每個(gè)反應(yīng)是20-50cp/PCR，那么是不是也可以宣稱這個(gè)試劑檢測(cè)下限是100cp/ml 呢，這豈不是有點(diǎn)亂套...

不亂套，以cp/ml計(jì)算，只管你樣本初始濃度，評(píng)估的是整套提取+擴(kuò)增的性能，檢出限只要你保證95%以上檢出率就行。我之前做HBV檢測(cè)，600多上樣量，做到2 IU/ml（＜12cp/ml，3cp/PCR）就這么做的。

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12樓2021-05-22 08:37:52

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xbwwsq

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另外，如果這1ml（100cp/ml）的樣本全部提取，然后用50ul洗脫，假設(shè)蒸發(fā)后剩30，上樣20ul的話，這樣計(jì)算下來(lái)每個(gè)反應(yīng)是20-50cp/PCR，那么是不是也可以宣稱這個(gè)試劑檢測(cè)下限是100cp/ml 呢，這豈不是有點(diǎn)亂套

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9樓2021-05-19 23:52:50

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8樓: Originally posted by xbwwsq at 2021-05-19 23:47:33
老師您好，謝謝您的回答，很好奇qPCR真能做到10 copy/反應(yīng)啊，我平時(shí)做實(shí)驗(yàn)挺粗放，沒(méi)有做過(guò)這么細(xì)。我現(xiàn)在做到500copy/反應(yīng)的Ct值就已經(jīng)34、35了，請(qǐng)問(wèn)這個(gè)原因是什么呢，是因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)的不夠好嗎。我的擴(kuò)增效率 ...

我自己做Taqman方法的，基本都在3~4 cp/PCR，100~1000cp/ml的水平，取決于提取體系、擴(kuò)增體系的大小。

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11樓2021-05-22 08:34:59

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tzynew2樓

2021-04-12 14:29 回復(fù)

xbwwsq(金幣+1): 謝謝參與

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2021-04-14 23:02 回復(fù)

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刀劈三關(guān)14樓

2021-10-04 21:27 回復(fù)

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