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細(xì)胞培養(yǎng)如何應(yīng)對支原體污染 已有1人參與
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一．支原體的介紹 支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細(xì)胞微生物，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原體在自然界分布廣泛，無細(xì)胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢，適宜生長溫度為35℃，適合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），對酸耐受性差，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時(shí)候，即應(yīng)懷疑支原體污染。細(xì)胞培養(yǎng)過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體，其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。 二．支原體的污染來源 （1）細(xì)胞之間交叉污染； （2）細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等； （3）工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染； （4）培養(yǎng)基的污染。 三．支原體污染的嚴(yán)重性 （1）細(xì)胞外形可以沒有明顯的變化，支原體可以與細(xì)胞共存，污染后細(xì)胞液不會死亡，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁； （2）使用被支原體污染的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因?yàn)橹гw會抑制細(xì)胞生長；導(dǎo)致染色體畸變；細(xì)胞膜抗原性改變；細(xì)胞復(fù)蘇后存活率降低等。 （3）影響細(xì)胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細(xì)胞代謝。 （4）培養(yǎng)過程中細(xì)胞破碎較多，培養(yǎng)基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養(yǎng)基； （5）細(xì)胞被支原體污染后會形成共生體系導(dǎo)致污染不斷擴(kuò)大。 四．支原體的檢測方法 支原體的污染需要特殊的檢查方法，常用的有 DNA 熒光染色法、支原體培養(yǎng)、ELISA、電鏡和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，由于支原體種類眾多，檢測有失敗的風(fēng)險(xiǎn)，通常推薦采用兩種以上的檢測方法。 2015版中國藥典規(guī)定：“主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、病毒種子批、對照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養(yǎng)法檢査支原體，必要時(shí)，亦可采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法篩選培養(yǎng)基。也可采用經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法�！� （1）DNA染色法：用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 Vero細(xì)胞DAPI染色熒光照片(400×)。A，感染支原體的Vero細(xì)胞。藍(lán)色卵圓形熒光物質(zhì)為Vero細(xì)胞核，其周圍藍(lán)色熒光小點(diǎn)為支原體(箭頭)；B，未感染支原體的陰性對照Vero細(xì)胞；C，加入待檢培養(yǎng)液的Vero細(xì)胞(未感染支原體)。 （2）低漲處理地衣紅染色觀察法：用2 %醋酸地依紅染色固定后，封片，鏡下觀察支原體呈暗紫色小體，附于細(xì)胞外或散在于細(xì)胞之間。 （3）培養(yǎng)法：將細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。 （4）ELISA：有專為支原體檢測開發(fā)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒，通過樣品顯色反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品對比得出結(jié)果。 （5）電鏡：一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。 （6）PCR：PCR檢測法靈敏度高，特異性強(qiáng)，只用一天時(shí)間即可快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體，是一種檢測支原體的有效手段。引物來自支原體的保守16S-23S的rRNA序列，由于這段spacer的序列隨支原體種類不同而不同，因此可依所復(fù)制的DNA大小及其特異性片段的大小來作檢測及鑒定，目前也有專門的試劑盒，如PCR Mycoplasma Test Kit（Applichem）。 還有一種利用了ERA恒溫核酸擴(kuò)增方法，靈敏度比普通PCR高百倍，可以在恒定的低溫條件下進(jìn)行，而且用時(shí)在30分鐘以內(nèi)，并且檢測范圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測方法。缺點(diǎn)就是試劑盒都是需要借助熒光定量檢測儀，儀器往往比較昂貴，不過該方法所有公司先達(dá)基因推出了專用的熒光定量檢測儀，由于ERA方法對溫度控制元件要求不高，所以該儀器相對比較便宜而且小巧。 PCR法支原體檢測電泳圖。+：陽性對照；-：陰性對照；1：送檢樣品1（感染支原體）；2：送檢樣品2（未感染支原體）；3：樣品1的干擾實(shí)驗(yàn)；4：樣品2的干擾實(shí)驗(yàn)。若在270bp處有條帶，檢測結(jié)果為陽性。陽性對照及干擾實(shí)驗(yàn)PCR產(chǎn)物在270bp處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。 五．避免支原體污染的方法 細(xì)胞培養(yǎng)中要從多方面避免支原體的污染： （1）控制環(huán)境污染：可以使用支原體清除噴霧（Mycoplasma-Off）進(jìn)行空間消毒；用新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室或用甲醛熏蒸法消毒無菌室；生物安全柜或超凈工作臺也要定期消毒；每次使用生物安全柜或超凈工作臺后要做好清潔工作，減少不必要的物品堆放在內(nèi)部；在水浴鍋中加入消毒試劑，如Aquabator-Clean（Applichem）；在培養(yǎng)箱的水源中加入消毒試劑，如Incuwater-Clean（Applichem）。 （2）嚴(yán)格操作要求：工作開始要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具（如移液槍等）要嚴(yán)格區(qū)分；在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)菌帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定嚴(yán)格的管理制度，按照規(guī)范的實(shí)驗(yàn)程序操作。 （3）保證細(xì)胞培養(yǎng)基和器材無菌，器材一般都經(jīng)過輻射處理，基本可以保證無菌，商業(yè)化CD培養(yǎng)基一般也能保證無菌。如實(shí)驗(yàn)室有發(fā)現(xiàn)支原體感染，已經(jīng)開啟的培養(yǎng)基不宜繼續(xù)使用。 （4）在培養(yǎng)基中加入適量抗生素：對支原體比較有效的抗生素為四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類，如卡那霉素50μg/ml，一些氟喹諾酮也有抑制支原體生長的作用。也有專用的支原體清除劑可用來預(yù)防細(xì)胞被支原體污染，如在培養(yǎng)基中添加Plasmocin™ prophylactic，工作濃度5μg/ml。 （5）制備細(xì)胞的原始組織或器官污染：從來源可靠的原始組織或器官制備細(xì)胞。 （6）種子庫污染：從可靠來源引進(jìn)、使用細(xì)胞,特別是知名的信譽(yù)良好的專門機(jī)構(gòu),如ATCC、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心等,這些機(jī)構(gòu)對細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行一系列檢測。細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。建立良好的種子庫管理規(guī)章制度，并定期對實(shí)驗(yàn)室中的培養(yǎng)物進(jìn)行支原體檢測。 六．細(xì)胞被支原體污染后的清除策略 （1）對于非重要的細(xì)胞，如培養(yǎng)中的細(xì)胞、WCB的細(xì)胞等，將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細(xì)胞，如來源珍貴或?qū)嶒?yàn)室中細(xì)胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。 （2）用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，如Plasmocin™ treatment，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。 （3）用清洗純化法清除支原體污染的方法：細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌，其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。 （4）藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。 （5）使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。 （6）動物體內(nèi)接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細(xì)胞接種在同種動物皮下或腹腔中，借動物免疫系統(tǒng)消滅支原體，而腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時(shí)間后，從體內(nèi)取出細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。 （7）巨噬細(xì)胞吞噬法：從動物腹腔采取巨噬細(xì)胞，為排除其它細(xì)胞成分，可先進(jìn)行純化，然后再加入被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體已被消除干凈為止。 （8）使用支原體清除培養(yǎng)基，每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時(shí)用無菌的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞1~2次；期間如果細(xì)胞密度過大，請保持細(xì)胞密度適當(dāng)（貼壁細(xì)胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養(yǎng)器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測支原體是否殺滅完全；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細(xì)胞再次受到“支原體”的污染，以后每隔1個月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測，以保證沒有新的支原體污染。 總結(jié) 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率超過50%，支原體存在水平較高的研究項(xiàng)目的成果還曾見刊于包括細(xì)胞（Cell）、自然（Nature）和美國科學(xué)院院報(bào)（Proceedings of the National Academy of Sciences）等知名雜志。雖然支原體污染的存在并不能說明這些研究發(fā)現(xiàn)是無效得，但這種細(xì)菌卻可以影響數(shù)百個基因的表達(dá)水平，并且通過與細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)而阻礙細(xì)胞的生長。因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中的支原體污染是一個世界性難題。當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。同時(shí)支原體可透過一般過濾膜（0.22-0.45μm），對于生物制藥領(lǐng)域而言，小試中我們幾乎不會使用0.1μm的除病毒過濾膜來過濾培養(yǎng)基（生產(chǎn)中通常都會進(jìn)行除病毒來保證原液質(zhì)量），那么小試結(jié)果在支原體污染的情況下就顯得不那么可靠了，尤其是科研工作者往往不會在第一時(shí)間懷疑自己的培養(yǎng)物受到了支原體的污染。對于這種情況，根據(jù)筆者的實(shí)驗(yàn)室的管理經(jīng)驗(yàn)，支原體污染的預(yù)防更為重要，在新的細(xì)胞株入庫時(shí)，做好支原體等相關(guān)檢驗(yàn)；規(guī)范無菌操作；操作人員在細(xì)胞培養(yǎng)與配置培養(yǎng)基時(shí)避免不必要的交談、佩戴口罩、手套與帽子；維持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境衛(wèi)生；做到以上幾點(diǎn)基本可以避免支原體的污染。另外，準(zhǔn)備一些支原體檢測試劑盒也是很有必要的。 |
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