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PCR 標(biāo)準(zhǔn)操作流程 已有1人參與
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本文介紹了 PCR 的詳細(xì)操作流程，強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，列舉了常用緩沖液的配方。幫助我們?cè)诶斫鈱?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上更順利的操作。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外合成雙鏈 DNA 的一種方法，其原理類似于天然 DNA的復(fù)制過(guò)程，其特異性主要依賴于與其目的片段兩端互補(bǔ)的特異引物和高特異性的酶（熱啟動(dòng)酶） 。典型的 PCR反應(yīng)有三個(gè)步驟：變性，退火，延伸，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，獲得目的片段。 一．試劑準(zhǔn)備 1.DNA 模板 2.特異性引物 3.dNTP Mix 4.PCR buffer 5.熱啟動(dòng)酶 二．操作步驟 1.配置反應(yīng)體系 將各成分依次加入到 0.5ml 的離心管中 擴(kuò)增使用熱啟動(dòng)酶，可在常溫下操作，非熱啟動(dòng)型的酶要在低溫配置反應(yīng)體系。 2.按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)置反應(yīng)時(shí)間和溫度，擴(kuò)增結(jié)束后電泳鑒定 3.瓊脂糖核酸電泳 · 將電泳所用器具蒸餾水洗凈，架好梳子 · 根據(jù)要分離的 DNA 片段大小制備合適濃度的瓊脂糖凝膠，準(zhǔn)確稱取一定的瓊脂糖加入到錐形瓶中，加入 30ml 左右的電泳緩沖液（TAE 或 TBE） · 在微波爐中加熱融化后冷卻至 40℃左右，充分混勻后倒入電泳槽中 · 室溫下凝固 40 分鐘左右，小心拔出梳子，將凝膠放置電泳槽中準(zhǔn)備點(diǎn)樣 · 在電泳槽中加入電泳緩沖液，漫過(guò)凝膠表面即可，點(diǎn)樣孔內(nèi)不要有氣泡 · 樣品點(diǎn)樣前準(zhǔn)備好，（在八連管中）加入 5ul 樣品，1ul 的 6xLoding buffer 和 1ul 的染料混合，用搶將混合后的樣品緩緩注入到點(diǎn)樣孔中，注意不要串孔 · 按照正負(fù)極（紅正黑負(fù)），接通電源，電壓 40-60V，時(shí)間 30-40min，可根據(jù)溴酚藍(lán)的位置判斷是否終止電泳 · 電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，凝膠成像觀察，并對(duì)比 marker 確定片段大小 不同的瓊脂糖濃度分離不同大小的 DNA 片段 三．注意事項(xiàng) 引物 引物是決定 PCR 反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，要保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確、高效，引物的設(shè)計(jì)要遵循如下原則： 1. 引物的設(shè)計(jì)在 cDNA 的保守區(qū)域，在 NCBI 上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析的軟件，得到不同基因相同的序列就是該基因的保守區(qū) 2. 引物的長(zhǎng)度：15-28bp，長(zhǎng)度大于 38bp，會(huì)使退火溫度升高，不利于普通 Taq 酶的擴(kuò)增 3. 引物 GC 含量在 40%-60%，Tm 值最好接近 72℃ 4. 因密碼子的簡(jiǎn)并性，引物的 3’端最好避開密碼子的第三位（最好為 T） 5. 堿基分布錯(cuò)落有致，3’端不超過(guò) 3 個(gè)連續(xù) G 或 C 6. 引物自身不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物設(shè)計(jì)完成，要 BLAST 驗(yàn)證 模板 PCR 擴(kuò)增對(duì)模板的要求不高，單鏈、雙鏈 DNA 均可作為擴(kuò)增片段，雖然 PCR 能夠擴(kuò)增微量的 DNA，為了保證擴(kuò)增的特異性，對(duì)不同來(lái)源的模板，起始濃度有一定要求 模板可以是純化后的樣品也可以是粗制品，不同來(lái)源的模板采取不同的處理方法，實(shí)驗(yàn)?zāi)０宓募兓胶?jiǎn)單越好，但模板中如果含有任何的 Taq 酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等，會(huì)干擾反應(yīng)。模板提取注意保存，不能放置太久，避免反復(fù)凍融并防止降解。多數(shù)人會(huì)忽略這一問題，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有任何條帶時(shí)，可優(yōu)先考慮是否為模板降解的原因。 舉例：細(xì)菌 DNA 的提取方法 1. 取 1-2ml 的菌液，12000rpm 離心 10min，去除上清，得到沉淀 2. 根據(jù)得到沉淀量，加入 500ul 左右的 TE（配方如下）懸浮沉淀，并加入 20ul 的溶菌酶，37 度保溫 30min 3. 加入 30ul 10%的 SDS 和 1mg 蛋白酶 K，混勻后 37 度保溫 1h 4. 加入 120ul 5mol/l 氯化鈉，充分混勻，65 度放置 10min 5. 等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）充分混勻，12000rpm 離心 5min，得上清于干凈的 EP 管中 6. 等體積的氯仿：異戊醇（24:1）充分混勻，12000rpm 離心 5min，得到上清于趕緊 EP 管中 7. 加入等體積的異戊醇，充分混勻，-20℃放置 30min 后 10000rpm 離心 5min 8. 去除上清，得到 DNA 沉淀用 70%的乙醇漂洗（動(dòng)作輕柔，不要講沉淀沖起），吸干，通�？色@得 3-5ug 的DNA 其他 1. Taq DNA 聚合酶：Taq 酶種類有很多，熱啟動(dòng)酶，高保真酶，根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用選擇合適的酶擴(kuò)增，一般的反應(yīng)，化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)酶即能很好的完成，化學(xué)修飾熱啟動(dòng)酶能夠避免低溫下任何非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。酶的濃度對(duì)擴(kuò)增有一定影響，酶用量過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物，操作按照說(shuō)明書即可。 2. dNTP：四種 dNTP 的濃度要相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)引發(fā)堿基的錯(cuò)誤滲入。此外，dNTP能夠和體系中鎂離子結(jié)合，從而影響體系中鎂離子的濃度。 3. 緩沖液：緩沖液一般隨酶提供，一般的 PCR 試劑盒包括 Taq 酶，緩沖液，dNTP，水。初次擴(kuò)增，可以完全按照試劑盒的說(shuō)明書操作，如果擴(kuò)增結(jié)果有問題，可自己嘗試摸索實(shí)驗(yàn)條件或重新設(shè)計(jì)引物提取模板擴(kuò)增。 4. 因空氣中和手上有一定污染源，操作過(guò)程中要戴手套，在干凈的環(huán)境中配置反應(yīng)體系，防止空氣中的污染源。 5. PCR 擴(kuò)增的水要經(jīng)過(guò)高壓滅菌或 0.2um 濾膜過(guò)濾。 6. 產(chǎn)物切膠回收二次擴(kuò)增前，要先鑒定，二次擴(kuò)增模板稀釋 1000 倍。 四．常用試劑配方 電泳緩沖液 1. 50xTAE（pH8.5） 準(zhǔn)確稱取 Tris 242g，EDTA（Na）37.2g 于 1L 燒杯中，加入 800ml 去離子水，攪拌溶解，接入 57.1ml 乙酸，充分?jǐn)嚢�，調(diào) pH 值 8.5 后定容至 1L，室溫保存。每次使用時(shí)稀釋即可。 2. 10xTBE（pH8.3） 準(zhǔn)確稱取 Tris 108g，EDTA 7.44g 硼酸 55g 于 1L 的燒杯中，加 800ml 去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓{(diào) pH8.3 后定容至 1L，室溫保存。每次使用前稀釋即可。 上樣緩沖液 6xLoding buffer 0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)，30%甘油溶于雙蒸水中，4℃保存。 （轉(zhuǎn)自先達(dá)基因 www.gendx.cn） |
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2樓2020-09-23 17:30:42
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