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一種細胞支原體污染快檢方法介紹 已有1人參與
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作為一個基礎醫(yī)學科研狗，最頭疼的莫過于細胞污染，真菌、細菌污染還好說操作得當就可以避免，而且顯微鏡下容易觀察到，最惡心的要數(shù)支原體污染，污染之后細胞還能生長，觀察不出什么異樣，但是實驗數(shù)據(jù)往往無法重復，嚴重影響實驗結(jié)果。 現(xiàn)在市場上有一些可以清除支原體的試劑，說實話我是不會用的，清除徹不徹底不說，對實驗有啥影響也不好說。檢測到污染的細胞，一個字——扔。檢測支原體污染也是一道繁瑣的工序，試想每批細胞都得檢測一次，檢測一次花一天功夫。后來網(wǎng)上查到一種革命性的細胞污染支原體檢測試劑盒，每次檢測只需半個小時，給我減少了很多工作量，這么好用的東西當然要分享安利一波。 這種支原體檢測試劑盒是由我國蘇州先達基因公司（www.gendx.cn）研發(fā)的，其原理是基于該公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進行特異性的擴增，擴增反應可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支原體。 ERA核酸擴增技術(shù)的核心是一套等溫核酸擴增組合酶制劑。通過酶工程改造，將來源于細菌和病毒的特定工具酶進行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴增反應體系進行優(yōu)化組合，從而獲得多種酶蛋白為核心的等溫擴增體系。配好的反應體系在各種實時熒光定量儀或者該公司自主研發(fā)的簡易恒溫熒光檢測儀中，可實現(xiàn)恒溫擴增與熒光信號檢測于一體，通過實時熒光擴增曲線在20min內(nèi)就可通過檢測儀的顯示屏讀出檢測結(jié)果，檢測過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合該公司提供的一步法提取DNA的試劑，進一步簡化了支原體檢測操作，5min完成細胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測，整個過程只需30min。 細胞培養(yǎng)是生命科學研究、生物制藥、臨床細胞治療等領(lǐng)域最核心的環(huán)節(jié)，但是細胞在培養(yǎng)過程中極易受到污染，其中支原體污染是最普遍的污染源，污染細胞的平均比例為30-60%，有些國家甚至高達80-90%。支原體污染的細胞生長緩慢、細胞變形、碎片增加、懸浮細胞容易成團、培養(yǎng)基提前變色，進而導致細胞實驗無法重復，生物制藥中產(chǎn)品不合格，細胞治療效果失效甚至進一步危害病人健康。 支原體是生物體中最小的無細胞壁的原核細胞，直徑約為0.2-0.3 um，可以通過常用的除菌濾膜(0.22-0.45um)，導致細胞培養(yǎng)中很難避免支原體的污染，而且無法通過普通顯微鏡觀察到，由于無細胞壁普通的抗生素對它根本不起作用。 從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求涉及細胞培養(yǎng)的投稿文章，要求必須進行支原體檢測，截止目前，大量的SCI期刊都跟進這項要求。為了提高動物細胞培養(yǎng)生物制品的質(zhì)量和安全性，中華人民共和國藥典規(guī)定主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞應進行支原體檢測。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定，應該用合適的方法檢測細胞的支原體污染狀況。歐洲藥典規(guī)定對細胞治療產(chǎn)品需要進行嚴格的支原體檢測。 以上這些要求和規(guī)定，再加上支原體的特性和污染的后果都指向一點——支原體分子檢測成為細胞培養(yǎng)必不可少的環(huán)節(jié)。 到目前為止，出現(xiàn)了各種各樣的支原體檢測方法，包括培養(yǎng)法，DNA熒光染色法，電子顯微鏡法、相差顯微鏡檢測法、3-H胸腺嘧啶摻入法、ELISA法、PCR（qPCR）法等等，但是這些方法或是因為敏感性差容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，或是因為檢測范圍小不能檢測到所有的支原體污染，或是因為試驗周期長費時費力。如今先達基因研發(fā)的基于其ERA技術(shù)的支原體檢測試劑盒可以克服以上提到的所有問題，使支原體檢測如此簡單準確。  |
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