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[交流]
CTC（循環(huán)腫瘤細胞）的精準(zhǔn)分型和單細胞測序前瞻
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2019年4月12日，在中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）乳腺癌年會上，江澤飛教授公布了《2019 CSCO乳腺癌診療指南》。 新《指南》第八部分明確提到循環(huán)腫瘤細胞（CTC）：CTC是指從惡性腫瘤原發(fā)部位脫落，通過血管或淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)的細胞，它能夠反映腫瘤組織的情況，也可以用無創(chuàng)方式替代組織樣本進行病理診斷、疾病監(jiān)測、分子測序等，不僅可以動態(tài)監(jiān)測，還可以用于判斷預(yù)后。隨著對CTC認(rèn)識的拓展，其應(yīng)用已經(jīng)從數(shù)目走向了精準(zhǔn)分型和單細胞測序時代。 CTC是如何轉(zhuǎn)移的？ 實體腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞在特定條件下，通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從形態(tài)上發(fā)生向間質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力。間充質(zhì)細胞與上皮細胞相鄰，只是其結(jié)構(gòu)松散，缺乏細胞連接（cell adhesion）和細胞極性，并且具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力。因此，脫落的CTCs得以進入外周血循環(huán)，這是腫瘤發(fā)生的必要前提。脫離原發(fā)灶入血的CTCs至少面臨著血流剪應(yīng)力、失巢凋亡、免疫細胞識別殺傷等三重致命考驗，進入循環(huán)的大部分腫瘤細胞都會失去活性，只有不足0.01%可到達遠端器官，通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在適合的微環(huán)境條件下，CTCs又發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition MET），生成新的腫瘤，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。 CTC的臨床意義 1 腫瘤早期診斷 有研究發(fā)現(xiàn)，CTC在肺癌臨床確診前，在慢阻肺病人血液中發(fā)現(xiàn)，比臨床確診早1-4年不等。因此，CTC檢測也可以用于腫瘤的早期診斷。 2 腫瘤預(yù)后判斷 多中心研究發(fā)現(xiàn)：CTC數(shù)量多的患者預(yù)后明顯較CTC數(shù)量低的患者差；其PFS和OS均明顯短于后者，總體存活時間平均少10個月以上。因此，CTC的數(shù)量與預(yù)后具有非常顯著的相關(guān)性。 3 實時監(jiān)測療效 研究表明在治療過程中監(jiān)測CTC數(shù)量的變化，可以得知治療方案是否有效，是否可以幫助患者控制病情、提高生存期，并協(xié)助判斷預(yù)后情況。 4 制定/調(diào)整治療方案 將CTC捕獲出來進行培養(yǎng)，進一步對其進行基因測序、mRNA表達和蛋白表達情況分析，為患者制定/調(diào)整治療方案，達到個體化治療目的。 CTC的捕獲 每10 ml血液中可能僅含有幾個到幾十個CTC，而含有的白細胞約1億個，紅細胞約500億個。所以如何將CTC與這些細胞分離呢？目前主要有這三種技術(shù)。 （見圖1） 技術(shù)瓶頸？ CTC的臨床試驗中廣泛使用到的還是十幾年前上市的CellSearch平臺（免疫磁珠法）。CellSearch平臺由強生公司開發(fā)，通過EpCAM（上皮細胞黏附分子）富集CTC細胞。這一平臺雖然穩(wěn)定性好，但只能在乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌中應(yīng)用，在一些癌癥（如非小細胞肺癌）中靈敏度較低，即使是在晚期腫瘤患者樣本中，檢出率也并不高。這是因為有部分CTC經(jīng)過EMT（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）之后，上皮標(biāo)志物表達量降低同時細胞變形能力增強。這部分細胞會很難被CellSearch平臺檢測到。 雖然血液中的CTC數(shù)目一定是有研究價值的，但要對其價值進行挖掘，關(guān)鍵的一點是要驗證獲取到的每一個CTC都確定是腫瘤細胞，并挖掘其異質(zhì)性。這時候就需要對每個被捕獲的細胞進行單細胞測序。 CTC的全套解決方案 RareCyte平臺提供了從全血到單細胞測序的一體化解決方案。 1 試驗思路 （見圖2） 2 試驗原理 借鑒組織切片研究思路和方法學(xué)將細胞樣本固定在載玻片上進行后續(xù)研究。 （見圖3） 3 全球分布式臨床試驗 簡單的操作將全血制成片子，-20℃可以保存超過12個月！ 4 試驗流程 （見圖4） AccuCyte®樣本制備系統(tǒng) 分離全血中全部有核細胞。 將全部有核細胞固定在載玻片上，過程簡單、重復(fù)性好，無需進行細胞的沖洗、裂解。 設(shè)置了不同的彈性停止點，工作流程彈性強，方便各種場景使用。 系統(tǒng)設(shè)計保證目標(biāo)細胞幾乎無丟失。 CyteSealer®獨有專利的捕獲系統(tǒng) AccuCyte組件的工程設(shè)計可將血液精確分層，將有核細胞層收集到細胞收集管中，最大程度地減少靶細胞的丟失。 CyteSealer裝置對分離管周圍的可變形金屬環(huán)施加均勻的高壓，浮起浮漂以形成不可逆的密封。在有核細胞層和浮漂下面的紅細胞之間形成了一個永久的屏障。 RarePlexTM多靶點染色解決方案 基于RarePlex™ 的試劑盒+定制Markers（4+2或3+3）。 RareCyte 已有的Marker 列表中選擇完成Panel組合。 RarePlex 染色試劑盒完全兼容Leica 和Dako/Ventana 全自動染色機。 （見圖5） CyteFinder®全景成像 7熒光通道全自動、高速全景掃描涂片。 對血液、穿刺樣本或細胞樣本進行全景成像。 彈性的顯微成像體系可方便的融入任何常規(guī)或定制分析的流程，進行樣本追蹤和數(shù)據(jù)管理。 CyteMapper®精準(zhǔn)分型數(shù)據(jù)庫 基于500+參數(shù)，5000多病例的CTC精準(zhǔn)分型數(shù)據(jù)庫對CTC進行智能識別、計數(shù)和分型。 機器學(xué)習(xí)智能識別目標(biāo)細胞，并對目標(biāo)細胞進行優(yōu)先級排序，便于用戶瀏覽確認(rèn)。 CytePicker®單細胞提取系統(tǒng) 基于針頭式的物理方法的單細胞提取，不破壞DNA/RNA。 單個細胞從玻片提取到PCR管中，提取結(jié)果確認(rèn)。 進行后續(xù)的DNA/RNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)&基因組學(xué)研究。 5 與CellSearch的結(jié)果對比 對前列腺癌的100多名患者和乳腺癌的上千名患者樣本進行檢測，可以看到，無論是前列腺癌還是乳腺癌，RareCyte的線性關(guān)系都要稍優(yōu)于CellSearch。 可以保證有核細胞的無損捕獲/細胞RNA無損傷！ 6 平臺優(yōu)勢 RareCyte唯一實現(xiàn)個位數(shù)稀有細胞捕獲的平臺！ AccuCyte稀有細胞涂片制備 基于離心的原理，專利的產(chǎn)品保證有核細胞的幾乎無損失捕獲； 無需紅細胞裂解液，因此不降解細胞。 無偏見 所有的有核細胞均在收集于玻片上。 特異性 多達6-7個通道的多靶標(biāo)檢測，精準(zhǔn)分型。 附：RareCyte除了CTC的應(yīng)用，在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查和藥物伴隨診斷領(lǐng)域均展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。 參考文獻 趙麗娜，趙曉航. 循環(huán)腫瘤細胞單細胞測序——液體活檢的新視角[J]. 生命科學(xué), 2018,30(1)：63-73. Inhestern J, Oertel K, Stemmann V, et al. Prognostic Role of CirculatingTumor Cells during Induction Chemotherapy Followed by Curative Surgery Combinedwith Postoperative Radiotherapy in Patients with Locally Advanced Oral andOropharyngeal Squamous Cell Cancer[J]. Plos One, 2015, 10(7). Li T T, Liu H, Li F P, et al. Evaluation ofepithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells in patients withresectable gastric cancer: Relevance to therapy response[J]. World Journal ofGastroenterology, 2015, 21(47):13259. Liu Y, Ling Y, Qi Q, et al. Prognostic valueof circulating tumor cells in advanced gastric cancer patients receivingchemotherapy.[J]. Molecular & Clinical Oncology, 2017, 6(2):235. Nieva J, Wendel M, Luttgen M S, et al. High-definition imaging of circulating tumor cells and associated cellularevents in non-small cell lung cancer patients: a longitudinal analysis.[J]. Physical Biology, 2012, 9(1). 圖2 圖1 圖3.png 圖4.png 圖5.png |
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tzynew2樓
2020-08-25 18:07
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＊一一(金幣+1): 謝謝參與
nono20093樓
2020-08-27 10:09
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蘇州華博4樓
2020-08-27 12:59
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1
2020-08-28 16:27
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＊一一(金幣+1): 謝謝參與
psylhh6樓
2020-08-31 22:36
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