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酶切連接不成功 已有4人參與
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酶切連接總是沒有陽性子，我的基因是菌p得來的，三個(gè)基因，我用overlap連起來總長3900bp，載體是petduet-1，酶切位點(diǎn)ecor1和hind3做了一個(gè)多月了，試過各種連接比例。我現(xiàn)在在想會(huì)不會(huì)是我目的基因有什么問題？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，考慮做陽性對(duì)照。 1. 第一個(gè)陽性對(duì)照，PCR一個(gè)短片段（500-1000bp即可），接口酶依然是ecor1和hind3，連接載體依然是petduet-1，如果能連接不成功，說明你整個(gè)酶切/連接/轉(zhuǎn)化體系可能有問題。 2. 大片段連接和轉(zhuǎn)化的存在效率問題，你的片段+載體都有9K多了。建議你做一個(gè)對(duì)照，3900bp的片段 連 T載體（這個(gè)長度可能會(huì)有連接效率的問題，轉(zhuǎn)化效率不存在瓶頸），如果連接不成功，說明你現(xiàn)在的連接體系對(duì)于大片段的效率非常低。如果成功了，你的片段以后就不許需要通過PCR制備了，也會(huì)后續(xù)的步驟省力。 3. 9K的質(zhì)粒，熱轉(zhuǎn)如果效率不高，考慮換感受態(tài)，或者電轉(zhuǎn)。這個(gè)要看你自己實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)了，當(dāng)然也有人會(huì)告訴你，9k的質(zhì)粒一點(diǎn)也不大。 4. 我從來都是不算連接比例的，片段絕對(duì)是超量的，就算片段自連也長不出菌。 |
12樓2020-08-22 08:42:07
藥學(xué)小生
新蟲 (初入文壇)
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2樓2020-08-18 20:01:36
qaz199018
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3樓2020-08-18 21:52:54
junjieshao
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4樓2020-08-19 04:18:39
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