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supergrape金蟲 (小有名氣)
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[求助]
關于使用自殺質粒pK18SacB進行敲除受體菌基因組上的相關片段 已有2人參與
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| RT，我在前期將pK18SacB進行改造，把卡那霉素基因替換為氯霉素（受體菌帶有卡那霉素抗性），左右同源臂的長度大小是在500bp左右，構建好的自殺載體pK18SacB是利用大腸桿菌S17進行接合轉移，將濾膜上的菌體洗脫后涂到含有卡那霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上。雙抗板上確實長出疑似單交換的菌株（受體菌是假單胞菌，菌落形態(tài)與大腸桿菌不一樣，很容易分辨），同時涂到雙抗板上的受體菌沒有長。問題是，當我用左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物進行菌落PCR驗證，結果只有一左同源臂+右同源臂的目的條帶，沒有左同源臂+敲除片段+右同源臂的目的條帶（PCR延伸時間是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂的長度進行設置的）。隨后，我設計了基因組上左同源臂的上游引物+自殺質粒中右同源臂下游引物進行pcr，結果沒有相關目的條帶（PCR延伸時間是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂+300 bp的長度進行設置的）。懇請大佬解釋一下，雙抗板上的菌株是單交換的菌株嗎？ |
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2樓2020-01-01 21:13:28
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感謝參與，應助指數(shù) +1
supergrape: 金幣+100, ★有幫助 2020-01-12 20:21:20
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supergrape: 金幣+100, ★有幫助 2020-01-12 20:21:20
| 左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物 PCR 產物送測序，如果是你設計的同源臂，那應該是成功的 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
supergrape3樓2020-01-02 19:54:08
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7樓2020-01-05 09:13:50
8樓2020-01-05 10:26:47
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10樓2020-01-06 13:59:49
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